Селекция с помощью мутагенеза и оптимизация ферментации внеклеточных пивных дрожжей, продуцирующих глутатион

 Глутатион (GSH), или γ-глутамил-L-цистеин-глицин, - это аминокислота, состоящая из трех аминокислот (глутамата, цистеина и глицина) в составе глутамилцистеин-синтетазы и глутатион-синтетазы из

GSH - это небелковый тиоловый трипептид, синтезируемый под непрерывным воздействием [1], который играет важную роль в защите клеток от антиоксидантного повреждения и поддержании внутриклеточного гомеостаза [2-4]. GSH широко используется в таких областях промышленности, как пищевая [5-7], косметическая [8] и фармацевтическая [9-12], его можно использовать в качестве антиоксиданта и ароматизатора, который может эффективно предотвратить подрумянивание продуктов и сохранить их уникальный вкус [13-16], и его можно использовать в качестве поглотителя свободных радикалов, который может защитить почки и улучшить детоксикацию печени [17-18].GSH можно использовать в качестве поглотителя свободных радикалов, который может защитить почки и улучшить детоксикацию печени [17-18]. Он также может быть использован в качестве средства для удаления свободных радикалов, которое может защитить почки и усилить детоксикационную способность печени [17-18].

 

В настоящее время микробная ферментация является наиболее распространенным методом промышленного производства GSH [19-20], однако, будучи внутриклеточным продуктом, производительность и экономические преимущества выделения GSH после ферментации не могут эффективно удовлетворить рыночный спрос, что в определенной степени ограничивает развитие его индустриализации. Если внутриклеточный GSH ферментирующих штаммов может эффективно секретироваться во внеклеточный, очищенный GSH может быть приготовлен непосредственно в ферментационном бульоне, что упрощает процесс экстракции и снижает сложность выделения и очистки GSH в дальнейшем, тем самым повышая производительность GSH. Если внутриклеточный GSH может быть эффективно секретирован во внеклеточный, то GSH может быть приготовлен и очищен непосредственно в ферментационном бульоне, что упрощает процесс экстракции и снижает сложность выделения и очистки GSH, тем самым повышая производительность GSH. В последние годы вопрос о том, как получить внеклеточные GSH-продуцирующие ферментационные штаммы, привлекает внимание ученых в стране и за рубежом[21] . Например, использование технологии генной инженерии для усиления внеклеточного транспорта GSH ферментационными штаммами[22-24] , или для улучшения проницаемости клеточной мембраны, чтобы способствовать экзоцитозу и накоплению глутатиона. Однако стоимость модификации и технические требования для создания внеклеточных ферментативных глутатион-инженерных бактерий высоки, а регулирование проницаемости клеточной мембраны - это метод химического проникновения органических реагентов [25], который не подходит для промышленного производства, учитывая влияние на активность роста штаммов и окружающую среду.

 

Традиционный метод селекции с помощью УФ-мутагенеза не только прост и быстр для отбора целевых штаммов, но и обеспечивает генетическую стабильность мутантных штаммов[26], однако в настоящем исследовании с помощью УФ-мутагенеза были проверены только внутриклеточные мутантные штаммы, продуцирующие глутатион, но не внеклеточные[27-29]. Поэтому в настоящем исследовании мы использовали Saccharmyces cere- visiae GAQ4 в качестве исходного штамма, отобрали генетически стабильный мутантный штамм с высокой внеклеточной продукцией глутатиона путем УФ-мутагенеза и далее увеличили внеклеточную продукцию GSH путем оптимизации условий ферментации, чтобы обеспечить новую ссылку для стратегии внеклеточной ферментации GSH и достичь промышленного производства внеклеточной ферментации GSH. Полученные результаты послужат новым ориентиром для стратегии внеклеточной ферментации GSH и промышленного производства GSH.

 

1 Материалы и методы

1.1 Материалы и реагенты

Saccharomyces cerevisiae GAQ4: промышленная ферментация в ключевой лаборатории Министерства образования, Хубэйский технологический университет, Хубэйский провинциальный центр совместных инноваций, лаборатория A610.

Глюкоза, дрожжевой порошок, пептон, сульфат аммония, дигидрогенфосфат калия, безводный сульфат магния, порошок агара, фосфорная кислота (все аналитически чистые): Sinopharm Chemical Reagent Corporation; 1-гептансульфонат натрия, глутатион (все аналитически чистые): Shanghai McLean Biochemistry Technology Co.

 

1.2 Инструменты и оборудование

SW-CJ-1D Single Purification Workbench: Suzhou Purification Equipment Co., Ltd; ZSD-12 Automatic Biochemical Incubator: Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Co. Sartorius Universal PH Meter (PB-10): Sartorius (Shanghai) Trading Co., Ltd; Электротермическая печь для шоковой сушки при постоянной температуре: Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co.

 

1.3 Метод испытания

1.3.1 Методы культивирования

Жидкая среда для семян: глюкоза 20 г/л, пептон 20 г/л, пекарский порошок 10 г/л, pH естественный.

Твердая среда для посева: глюкоза 20 г/л, пептон 20 г/л, пищевая сода 10 г/л, агар 20 г/л, pH естественный.

Среда для брожения: глюкоза 20 г/л, дрожжи 10 г/л, сульфат аммония 8 г/л, дигидрогенфосфат калия 3 г/л, сульфат магния 0,15 г/л, pH естественный.

Культура посевного материала: суспензию бактерий, сохраненную в пробирках с глицерином, добавляли в посевную среду и инкубировали в шейкере при 30 ℃ и 180 об/мин.

Культура ферментации: возьмите сок семян в период логарифмического роста и поместите его в среду ферментации с закваской 10% по объему, инкубируйте при температуре 30 ℃ и скорости 180 об/мин встряхивания бутылки.

 

1.3.2 Ультрафиолетовый мутагенез

Процесс мутагенеза: разогрейте УФ-лампу мощностью 15 Вт в течение 20 минут. Возьмите суспензию семенных бактерий в логарифмическом периоде роста, разбавьте суспензию до количества клеток 107 КОЕ/мл ~ 108 КОЕ/мл, возьмите 200 мкл раствора для разбавления и нанесите его на твердую среду для семян, затем немедленно поместите пластину среды на расстоянии 30 см от УФ-лампы для УФ-облучения, время облучения составляло 10, 20, 30, 40, 50 и 60 с, и каждая группа была создана в 3 параллелях, и количество отдельных колоний бактерий, выросших на каждой пластине, было подсчитано. Сразу после облучения пластины помещали вверх дном в инкубатор при температуре 30 ℃, чтобы избежать попадания света, и подсчитывали количество одиночных колоний, выросших на каждой пластине. Разбавленную бактериальную суспензию без УФ-облучения наносили на твердую среду и затем инкубировали в контрольной группе, защищенной от света. Рассчитайте УФ-мутагенную летальность: возьмите время УФ-облучения в качестве горизонтальной координаты и УФ-мутагенную летальность в качестве вертикальной координаты, и постройте кривую УФ-мутагенной летальности. Формула для расчета мутагенной летальности выглядит следующим образом.

 

Мутагенная летальность/% = (количество колоний на контрольной пластине - количество колоний на мутагенизированной пластине)/количество колоний на контрольной пластине × 100.

Итеративный УФ-мутагенез: используя содержание внеклеточного GSH в штамме в качестве скринингового индекса, GAQ4 подвергали итеративному УФ-мутагенезу, т.е. мутантные штаммы, отвечающие скрининговым индексам, полученным в результате предыдущей мутации, использовали в качестве исходных штаммов в следующей мутации, а затем снова проводили мутационный скрининг. Для получения достаточного количества мутантных штаммов и увеличения частоты положительных мутаций для каждого мутагенеза создавали три параллельные группы. Каждый УФ-мутагенез должен быть построен на основе летальной кривой УФ-мутагенеза, чтобы выбрать оптимальную мутагенную дозу для каждого поколения мутантных штаммов.

 

Тест на генетическую стабильность: Для того чтобы подтвердить, что полученные целевые штаммы обладают хорошей генетической стабильностью, целевые штаммы последовательно передавались 8 раз, и культура ферментации проводилась с 1-м, 4-м и 8-м поколениями, и содержание внеклеточного глутатиона, продуцируемого в результате ферментации, определялось и сравнивалось с содержанием, продуцируемым исходным штаммом, GAQ4, в качестве контроля. 1.3.3 Односторонний тест условий ферментации

Для изучения влияния периода ферментации, объема колбы для встряхивания, начального pH, температуры ферментации и скорости вращения колбы для встряхивания на содержание внеклеточного GSH в результате ферментации в колбе для встряхивания мутантных штаммов был проведен односторонний тест с использованием содержания внеклеточного GSH в качестве индикатора. Температура ферментации составляла 26, 30, 34, 38 и 42 ℃, а скорость вращения встряхивающей колбы - 120, 140, 160, 180 и 200 об/мин. Оптимальные условия ферментации мутантных штаммов в встряхивающей колбе были оптимизированы, и для определения оптимальных условий ферментации в встряхивающей колбе были взяты средние значения трех параллельных настроек каждого фактора.

 

1.3.4 Измерение биомассы

Определенный объем бактериальной суспензии центрифугировали при 8000 об/мин в течение 5 минут для сбора влажных бактериальных тел, бактериальные тела промывали стерильной водой 3 раза, затем сушили в печи при 65 ℃ до постоянного веса, после чего взвешивали для получения сухого веса клеток, а биомассу рассчитывали по следующей формуле.

Биомасса/(г/л) = сухой вес клеток (г) / объем бактериальной суспензии (л)

 

1.3.5 Определение глутатиона

Содержание GSH определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [30]. Условия хроматографирования были следующими: колонка Inertsil ODS-SP C18, подвижные фазы - гептансульфонат-фосфатный буферный раствор натрия (6,8 г 1-гептансульфоната натрия, 2,2 г фосфата калия, pH 3,0, скорректированный фосфорной кислотой, и метанол (90:10 объемное соотношение фосфатного буфера и метанола) при скорости потока 1,0 мл/мин. Подвижными фазами были гептансульфонат натрия-фосфатный буферный раствор (6,8 г 1-гептансульфоната натрия, 2,2 г дигидрогенфосфата калия, pH 3,0, отрегулированный фосфорной кислотой, и ультрачистая вода до 1 л) и метанол (объемное соотношение фосфатного буфера и метанола 90:10) при скорости потока 1,0 мл/мин.

Взвесьте 10 мг стандартного глутатиона, разбавьте до 10 мл сверхчистой водой, а затем разбавьте до концентраций 200, 400, 600, 800 и 1 000 мг/л. Площади пиков, соответствующие различным концентрациям GSH, были определены с помощью ВЭЖХ, и стандартная кривая была построена с концентрацией GSH в качестве горизонтальной координаты и площадью пика в качестве вертикальной координаты, и была получена кривая регрессии. Стандартная кривая была построена с концентрацией GSH в качестве горизонтальной координаты и площадью пика в качестве вертикальной координаты (Рисунок 1), и уравнение регрессии стандартной кривой было y=18 045x+168 919 с R2 =0,999 3, которое было использовано для расчета содержания GSH.

 

2 Результаты и анализ

2.1 Результаты селекции на мутагенез

 

2.1.1 Содержание внеклеточного GSH у отходного штамма GAQ4

Содержание внеклеточного глутатиона в GAQ4 составило 7,37 мг/л после ферментации в колбе на встряхивании в течение 48 ч. Содержание внеклеточного глутатиона в GAQ4 было использовано в качестве индикатора исходного штамма, а содержание внеклеточного глутатиона в GAQ4 сравнивали с содержанием глутатиона в мутанте, полученном путем мутагенеза.

 

2.1.2 Результаты скрининга УФ-мутагенеза

Используя содержание внеклеточного GSH в качестве индекса скрининга, исходный штамм GAQ4 подвергли УФ-итерационному мутагенезу в соответствии с методом 1.3.2. Результаты первого УФ-скрининга мутагенеза представлены на рис. 2.

После первой обработки УФ-облучением было отобрано 200 одиночных колоний, и из первичных отсеянных штаммов было отобрано 15 мутантных штаммов на основании высокого содержания внеклеточного глутатиона после ферментации (рис. 2В), среди которых содержание внеклеточного глутатиона в мутанте UV1-6 составило 13,87 мг/л, что на 88,20% больше, чем в исходном штамме, и он был отобран для продолжения скрининга методом УФ-мутагенеза. Мутантный штамм UV1-6 был выбран для продолжения скрининга УФ-мутагенеза.

 

Мутант UV1-6 был использован в качестве исходного штамма для второго УФ-мутагенеза, и результаты второго скрининга УФ-мутагенеза показаны на рис. 3. Из рис. 3A видно, что мутантный штамм показал летальность 78,6% при облучении УФ в течение 30 с, что выше, чем в предыдущем мутагенезе при той же дозе, поэтому мы решили использовать ту же дозу УФ-облучения для второй процедуры УФ-мутагенеза.

Как показано на рис. 3В, после второго УФ-мутагенеза было отобрано 14 мутантных штаммов с относительно высоким содержанием внеклеточного глутатиона, среди которых мутантный штамм UV2-2 имел содержание внеклеточного глутатиона 16,10 мг/л, что на 118,45% и 16,08% выше, чем у исходного штамма GAQ4 и мутантного штамма UV1-6, соответственно.

Мутант UV2-2 был подвергнут третьей обработке УФ-мутагенезом, и результаты показаны на рис. 4.

 

Как показано на рис. 4А, летальность третьей УФ-мутации явно увеличивалась после той же мутагенной дозы, и летальность достигала 69,5% при 10 с УФ-облучения и 81,9% при 20 с УФ-облучения, поэтому в качестве времени обработки третьей мутации было выбрано 15 с УФ-облучения. После отбора было получено 11 мутантов с высоким содержанием внеклеточного GSH. Как показано на рисунке 4B, содержание внеклеточного GSH в мутанте UV3-10, полученном в результате третьего мутагенеза, составило 19,08 мг/л, что на 158,89%, 37,56% и 18,51% выше, чем в исходном штамме, мутанте UV1-6 и мутанте UV2-2, соответственно. В результате проведенного анализа положительный мутационный эффект третьего мутагенеза был не столь очевиден, как у двух предыдущих, и содержание внеклеточного глутатиона повысилось лишь у небольшого числа мутантов, а у некоторых мутантов оно было даже ниже, чем до третьего мутагенеза, а летальность УФ-мутагенеза при той же мутагенной дозе постепенно увеличивалась, что выходило за пределы летальности высоковероятной положительной мутации, поэтому мы не проводили скрининг четвертого мутагенеза и не отбирали три УФ-мутации. Поэтому для следующего испытания были отобраны мутантные штаммы UV1-6, UV2-2 и UV3-10, полученные в результате третьего скрининга УФ-мутагенеза.

 

2.1.3 Результаты генетической устойчивости

Мутантные штаммы UV 1-6, UV 2-2 и UV 3-10, полученные в результате трех скринингов УФ-мутагенеза, были последовательно пропущены восемь раз, и содержание внеклеточного глутатиона было определено после ферментации культуры первого поколения, четвертого поколения и восьмого поколения, соответственно, и результаты представлены в таблице 1.

Наибольшее содержание внеклеточного глутатиона 18,56 мг/л было обнаружено в UV 3-10 в 8-й генерации, и ферментационные показатели UV 3-10 в производстве внеклеточного глутатиона были генетически стабильными, поэтому UV 3-10 был выбран в качестве целевого штамма.

 

2.2 Оптимизация условий ферментации

В исходных условиях ферментации в колбе со встряхиванием, т.е. при объеме заполнения колбы 100 мл/300 мл, естественном начальном pH, температуре ферментации 30 ℃ и скорости вращения 180 об/мин, содержание внеклеточного GSH в мутантном штамме составило 18,56 мг/л, а биомасса - 5,64 г/л. Для определения периода ферментации, объема заполнения колбы со встряхиванием, начального pH, температуры ферментации и скорости вращения, соответственно, для условий ферментации мутантного штамма были проведены оптимизационные испытания. Цикл ферментации, объем загрузки встряхиваемой колбы, начальное значение pH, температура ферментации и скорость вращения встряхиваемой колбы были оптимизированы с помощью однофакторного теста оптимизации. Влияние периода ферментации на выработку внеклеточного глутатиона целевым штаммом UV3-10 показано на рис. 5.

 

Как показано на рисунке 5, содержание внеклеточного глутатиона в мутантном штамме увеличивалось, а затем уменьшалось по мере увеличения времени ферментации. Содержание внеклеточного глутатиона в мутантном штамме составляло 18,97 мг/л при времени ферментации 48 ч. Содержание внеклеточного глутатиона начинало снижаться с увеличением времени ферментации, поэтому в качестве времени ферментации было выбрано 48 ч, а другие условия ферментации были оптимизированы на основе этого.

Влияние объема шейкера на выработку внеклеточного глутатиона целевым штаммом показано на рисунке 6.

 

 Из рис. 6 видно, что самое высокое содержание внеклеточного глутатиона в целевом штамме было обнаружено при объеме жидкости в шейкере 75 мл/300 мл, и содержание внеклеточного глутатиона начало снижаться при постепенном увеличении объема жидкости в шейкере, а большой объем жидкости в шейкере влияет на растворенный кислород в шейкере и, следовательно, на эффективность ферментации целевого штамма, поэтому оптимальный объем жидкости в шейкере был выбран равным 75 мл/300 мл.

Результаты оптимизации начального pH мутантного шейкера показаны на рисунке 7.

 

При увеличении начального значения рН с 5,0 до 6,0 содержание внеклеточного глутатиона практически не менялось, но при увеличении значения рН до 6,5 содержание внеклеточного глутатиона быстро увеличилось до 36,42 мг/л, затем стало уменьшаться с увеличением значения рН и достигло максимального значения при рН 6,5. Таким образом, было выбрано оптимальное начальное значение рН 6,5.

Влияние температуры ферментации на выработку внеклеточного глутатиона целевым штаммом показано на рисунке 8.

 

 Как показано на рисунке 8, температура ферментации оказывала большее влияние на содержание внеклеточного глутатиона в целевом штамме, чем другие факторы, а повышение температуры ферментации способствовало секреции внеклеточного глутатиона мутантным штаммом[31] . Содержание внеклеточного глутатиона в мутантном штамме увеличивалось с повышением температуры ферментации и достигло 40,63 мг/л при 34 ℃, что было в 1,68 раза выше, чем при 30 ℃. Когда температура ферментации была увеличена до 34 ℃, содержание внеклеточного глутатиона достигло 40,63 мг/л, что было в 1,68 раза больше, чем при температуре ферментации 30 ℃. Когда температура ферментации была увеличена до 42 ℃, содержание внеклеточного глутатиона в мутантном штамме достигло 17,15 мг/л, а биомасса мутантного штамма упала до самого низкого уровня, который составил 3,16 г/л. Поэтому оптимальная температура ферментации была выбрана на уровне 34 ℃.

Влияние скорости вращения встряхиваемой колбы на выработку внеклеточного глутатиона целевым штаммом показано на рисунке 9.

 

На количество растворенного кислорода в колбе-встряхивателе влияло количество жидкости, загруженной в колбу, и скорость вращения, сила сдвига, создаваемая скоростью вращения колбы, скорость массопереноса и количество жидкости, загруженной в колбу, влияли на количество инокулята, состояние роста, синтез и накопление продуктов ферментации штаммов, что видно на рис. 9. Содержание внеклеточного глутатиона было самым высоким при скорости вращения колбы-встряхивателя 140 об/мин, а содержание внеклеточного глутатиона в целевом штамме составляло 52,05 мг/л, что в 2,80 раза больше содержания внеклеточного глутатиона в целевом штамме до оптимизации. Содержание внеклеточного глутатиона в целевом штамме составило 52,05 мг/л, что в 2,80 раза выше, чем до оптимизации.

 

После оптимизации ферментации в встряхиваемой колбе содержание внеклеточного GSH в мутантном штамме достигло 52,05 мг/л через 48 ч ферментации, что в 2,80 раза выше, чем в предварительно оптимизированной ферментации, при объеме заполнения встряхиваемой колбы 75 мл/300 мл, начальном значении рН ферментации 6,5, температуре ферментации 34 ℃ и скорости вращения 140 об/мин.

 

3. обсуждение и выводы

В данном исследовании мутантный штамм UV3-10 был отобран для производства внеклеточного GSH с помощью итеративного УФ-мутагенеза, и его содержание внеклеточного GSH составило 18,56 мг/л. Оптимальные условия для ферментации в колбе с встряхиванием были получены с помощью одностороннего теста, который включал период ферментации 48 ч, объем загрузки 75 мл/300 мл, начальное значение рН 6,5, температуру ферментации 34 ℃ и скорость вращения 140 об/мин. После оптимизации содержание внеклеточного GSH в мутантном штамме составило 52,05 мг/л, что было в 2,80 раза выше, чем до оптимизации.

 

Механизм внеклеточной секреции мутантного штамма UV3-10 был предложен следующим образом: клеточная проницаемость мутантного штамма была изменена после мутагенеза, т.е. активность некоторых белков-экспортеров GSH была усилена или активность некоторых белков-деструкторов GSH была подавлена после мутагенеза, поэтому внутриклеточные вещества дрожжевых клеток специфически переливались во внеклеточную область, и накопление внеклеточного GSH происходило при нормальных условиях ферментации. Взаимосвязь между активностью транспортных белков глутатиона и системы GSH-синтетазы мутантных штаммов и механизмом их внеклеточной секреции может быть изучена в последующих исследованиях, а также вопрос о том, как поддерживать стабильность внеклеточного GSH в условиях нисходящей ферментации, также требует изучения.

 

Мутантный штамм UV3-10 способен секретировать внутриклеточно синтезированный GSH во внеклеточно синтезированный GSH, тем самым достигая эффективного накопления внеклеточного GSH, что значительно улучшает возможность промышленного получения GSH в ферментационном бульоне и снижает сложность очистки и выделения по сравнению с внутриклеточной экстракцией GSH, тем самым снижая стоимость производства и энергопотребление. Кроме того, Saccharomyces cerevisiae является безопасным для пищевых продуктов штаммом, которому отдают предпочтение разработчики продуктов питания, а результаты исследования производства внеклеточного GSH путем ферментации Saccharomyces cerevisiae открывают новые перспективы и экономическую выгоду для его применения в переработке, хранении и консервировании пищевых продуктов, а также в производстве функциональных ароматизаторов.

 

Ссылки:

[1] ANDERSON ME. Анализ ферментов биосинтеза глутатиона[J]. Аналитическая биохимия, 2022, 644: 114218.

[2] OESTREICHER J, MORGAN B. Glutathione: Subcellular distribution and membrane transport[J]. Биохимия и клеточная биология, 2019, 97(3): 270-289.

[3] BACHHAWAT A K, YADAV S. The glutathione cycle: glutathi - one metabolism beyond the γ-glutamyl cycle[J]. IUBMB Life, 2018, 70(7): 585-592.

[4] RAN Ling, HUANG Yan, ZENG Hongleng, et al. Antioxidant activi- ty and combined antioxidant effect of phenolic acids and glutathi - one[J]. Современная пищевая наука и технология, 2020, 36(3): 48-55.

[5] WANG Xiaowei, ZHANG Hongyan, LIU Rui, et al. Progress in re - search of glutathione[J]. Chinese Journal of Pharmaceutics (Online Edition), 2019, 17(4): 141-148.

[6] HAO Ying, CHEN Ye, WU Caiqin, et al. Производство глутатиона с помощью ферментированных рисовых отрубей[J] . Пищевые исследования и разработки, 2009, 30(6): 95-98.

[7] SU Jing, GONG Rong. Последние достижения в понимании глю- татиона в процессе виноделия[J]. Food Science, 2020, 41(7): 283-291.

[8] WANG Ting, ZHENG Yunyun, ZHA Jiansheng, et al. Сравнительное исследование применения восстановленного глутатиона и окисленного глу- татиона в косметике[J China Cosmetics Review, 2021(9): 92-97.

[9] VAŠKOVÁ J, DE MARTINO L, CAPUTO L, et al. Два представителя эфирных масел Lamiaceae и их основные компоненты вызывают изменения в глутатион связанной с глутатионом ферментативной активности[J]. Natural Prod- uct Research, 2022, 36(2): 680-686.

[10]LIU Yajuan, LI Xuesong, LI Qinyuan, et al. Исследовательский прогресс в лечении иммунозависимых заболеваний с помощью восстановленного глутатиона[J]. Журнал клинической медицины на практике, 2016, 20(17): 205-208.

[11] ZHANG Yi, YE Sheng. Physiological functions and clinical applica- tions of glutathione [J]. Химия жизни, 2020, 40(12): 2226-2235.

[12] SMIRNOVA G, MUZYKA N, LEPEKHINA E, et al. Роли глутатион- и тиоредоксин-зависимых систем в ответах кишечной палочки на ципрофлоксацина и ампициллина[J]. Archives of Micro- biology, 2016, 198(9): 913-921.

[13] BIJicai, LIN Zeyuan, ZHANG Yongsheng, et al. Исследование свойств глутатиона по улучшению вкуса неорганической соли[J]. China Co- ndiment, 2020, 45(5): 119-123.

[14] QI Yiman, CHENG Zhenggen, FAN Mingtao. влияние добавления глутатиона на компоненты аромата хранящегося вина из плодов киви[J]. Sci- ence and Technology of Food Industry, 2017, 38(8): 183-188.

[15] LU S Y, CUI H P, ZHAN H, et al. Своевременное добавление глутатиона для его взаимодействия с дезоксипентозоном для ингибирования водной реакции Майяра и ингибирования водной реакции Майяра и подрумянивания системы глицилглицин-арабиноза[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(23): 6585-6593.

[16] MO Yiwei, ZHENG Jixiang, LI Weicai, et al. Эффекты обработки аскорбиновой кислотой и глутатионом на плодах личи во время хранения после сбора урожая[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engi- neering, 2010, 26(3): 363-368.

[17] CHEN Liang, ZHOU Moxi, YAN Yali, et al. Экспериментальное исследование защитного действия функциональных солей растений на химическое повреждение печени у мышей[J]. China Condiment, 2019, 44(5): 28-32.

[18] ЛИ СЯ. Эффект восстановленного глутатиона в лечении вирусного гепа- тита[J]. Китайская современная медицина, 2018, 25(35): 25-27.

[19] LI Y, WEI G Y, CHEN J. Glutathione: A review on biotechnological production [J]. Прикладная микробиология и биотехнология, 2004, 66(3): 233-242.

[20] DONG Yongsheng, MA Lei, WANG Yanjie. Исследование условий ферментации глутатион-синтетазы, производимой S. cerevisiae[J]. Food Research and Development, 2016, 37(24): 152-155.

[21] TANG Liang, ZHOU Wenlong, WANG Wei. Исследовательский прогресс внеклеточной ферментации глутатиона[J]. Chinese Medicinal Biotec- hnology, 2015, 10(5): 428-431.

[22]QUAN Cong, ZHANG Jing, WU Hui, et al. Экспрессия CydDC в Escherichia coli и его влияние на транспорт глутатиона[J]. Вестник биотехнологии, 2016, 32(11): 255-260.

[23] KIRIYAMA K, HARA K Y, KONDO A. Внеклеточная ферментация глутатиона с использованием инженерии Saccharomyces cerevisiae, экспрессирующей новый экспортер глутатиона. экспортер глутатиона[J]. Прикладная микробиология и биотех- нология, 2012, 96(4): 1021-1027.

[24] ZULKIFLI M, BACHHAWAT A K. Идентификация остатков, критических для транслокации глутатиона с протонной связью в транспортера, Hgt1p[J]. The Biochemical Journal, 2017, 474(11): 1807- 1821.

[25] LIANG G B, MO Y W, DU G C. Оптимизация добавления дедецилсульфата натрия (SDS) в сочетании с регенерацией аденозинтрифосфата (АТФ) для перепроизводства глутатиона при высокоплотном культивировании Candida utilis[J]. Энзимные и микробные технологии, 2010, 46(6): 526-533.

[26] NISAMEDTINOV I, KEVVAI K, ORUMETS K, et al. Metabolic changes underlying higher accumulation of glutathione in Sac - charomyces cerevisiae мутантов[J]. Applied Microbiology and Biotec- hnology, 2011, 89(4): 1029-1037.

[27] LONG Qian, BAO Haodong, NING Xueping, et al. Mutagenesis scr- eening of high-yielding glutathione yeast and optimisation offermen- tation conditions [J. условий [J]. Advances in Microbiology, 2021, 10(1): 7-13.

[28] HUANG Jinghan, XU Jingran, LIU Aiping, et al. Скрининг Sac - charomyces cerevisiae с высокой продукцией глутатиона для приготовления сидра с функции здравоохранения[J]. Food & Machinery, 2016, 32(5): 182-187.

[29] LV Hongyan, CHEN Yefu, ZHOU Dawei, et al. Выведение штамма Saccharomyces erevisiae с высоким содержанием глутатиона и оптимизация условий его ферментации [J. условий ферментации[J]. Modern Food Science and Te- chnology, 2011, 27(5): 559-563.

[30] DU Lili, LUO Biying. Определение глутатиона в дрожжах методом стандартной кривой ВЭЖХ[J]. Liquor-Making Science & Techn- ology, 2017(6): 119-122.

[31] LAMAN TRIP D S, YOUK H. Yeasts collectively extend the limits of habitable temperatures by secreating glutathione [J]. Nature Micro- biology, 2020, 5(7): 943-954.