Как приготовить нанолипосомы с восстановленным глутатионом и высокой скоростью встраивания?

 Восстановленный глутатион (GSH) состоит из L-геми-, γ,-[и 1-2 в], содержащих сульфгидрильные, γ-глутамильные и другие функциональные группы, и проявляет антиоксидантные, детоксикационные, улавливающие свободные радикалы, противорадиационные и поддерживающие нормальную функцию белков и иммунной системы свойства[3] . Однако GSH имеет короткий цикл циркуляции в организме, легко окисляется и не может пересекать клеточную мембрану, что ограничивает его применение в здравоохранении и медицинском лечении[4- 5] . Исследования показали, что технология микро- и наноэмбеддинга может эффективно повысить стабильность GSH и его способность пересекать клеточную мембрану[6] . Naji-tabasi et al.[8] использовали камедь семян базилика для встраивания GSH, и приготовленные наночастицы GSH обладали хорошей стабильностью в желудочно-кишечной среде. Кроме того, Джой и др.[9] обнаружили, что GSH, встроенный в липосомные наночастицы, улучшает доставку лекарств в мозг.

 

Липосомы, представляющие собой микровезикулы, образованные липидным бислоем, обернутым в водный раствор, способны встраивать в себя не только липофильные, но и гидрофильные соединения[10] . Когда GSH встраивается в липосомы, бислой может уменьшить влияние факторов окружающей среды, таких как кислород и ионы металлов, на GSH и увеличить стабильность GSH; кроме того, поскольку фосфолипидный бислой имеет высокое сродство к клеточной мембране, легче транспортировать GSH в клетку, и в то же время он может предотвратить распад и разрушение GSH, так что GSH может высвобождаться медленно и биодоступность может быть улучшена[11] . Существует множество методов встраивания GSH в липосомы, таких как метод градиента рН, метод этанола и метод использования этанола в липосоме.

метод инжекции, метод обращенно-фазового испарения и метод тонкопленочного ультразвука[12] . В данной работе мы используем

 

Влияющие факторы (например, количество добавленного лецитина, количество добавленного Tween-80,

Взаимодействие добавления GSH, времени соникации и соотношения лецитина и холестерина было исследовано с целью получения оптимальных параметров процесса для получения нанолипосом с высоким содержанием GSH, что обеспечит теоретическую и экспериментальную основу для их применения в пищевой и медицинской промышленности.

 

1 Материалы и методы

1.1 Материалы и реагенты

Восстановленный глутатион (GSH), Shandong Jincheng Bio-Pharmaceutical Co., Ltd; соевый лецитин, Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd; холестерин, Soleilbao Bio-technology Co.

 

1.2 Инструменты и оборудование

JY99-Ⅱ D Ультразвуковая дробилка, Beijing Jiayuan Xingye Technology Co.

Ltd.; ферментный лабиринт Multiskan FC, Thermo Fisher (Shanghai) Instruments Ltd.; центрифуга 5039R, Eppendorf, Германия;

Измеритель FE20pH, METTLER TOLEDO INSTRUMENTS INC.

 

1.3 Метод испытания

1 .3 . 1 Построение стандартных кривых GSH

В результате реакции образуются 2-нитро-5-меркаптобензойная кислота и дисульфид глутатиона. 2-нитро-5-меркаптобензойная кислота имеет желтый цвет с максимумом поглощения при 412 нм[13] . Растворите 1 мг стандарта GSH в 1 мл дистиллированной воды, чтобы получить исходный раствор GSH с массовой концентрацией 1 мг/мл. Затем, согласно инструкции к набору для определения восстановленного глутатиона, добавьте 20 мкл стандартного раствора, 140 мкл реагента 2 и 40 мкл реагента 3 в центрифужную пробирку, хорошо перемешайте и дайте постоять 2 мин перед анализом при 412 нм. Поглощение измеряли при 412 нм после 2 минут стояния. За горизонтальную координату принимали массовую концентрацию GSH, за вертикальную - поглощение при 412 нм и строили стандартную кривую GSH.

 

1 .3 .2 Приготовление нанолипосом с восстановленным глутатионом

В данной работе нанолипосомы с добавлением GSH (GLip) были приготовлены по методу тонкопленочного сонирования Ласикда[14] . Определенное количество лецитина, холестерина и Tween-80 растворяли в 15 мл безводного этанола, смешанный раствор выливали в круглодонную колбу и ротационно выпаривали при 50 ℃ и - 0,1 МПа для удаления органической фазы и образования однородной и прозрачной пленки на стенке колбы. Затем добавляют 20 мл, 0,05 моль/л, рН 6,0 раствора PBS при 50 ℃, в условиях атмосферного давления для продолжения ротационной гидратации в течение 30 мин для промывки пленки; после того, как пленка была смыта, фосфатный буферный раствор (PBS) в ледяной бане при мощности 250 Вт для ультразвукового воздействия, обработки 1 с работы 1 с паузой 1 с режиме, при 20 ℃ статического в течение 2 ч, полученный GLip Образец GLip был перенесен во внутреннюю пробирку ультрафильтрационной центрифуги (с отсечкой молекулярной массы 10 кДа) и центрифугирован при 3000 об/мин в течение 20 мин для сбора фильтрата из внешней пробирки ультрафильтрационной центрифуги. Добавьте 2 мл дистиллированной воды во внутреннюю пробирку, повторно распределите концентрированный раствор GLip и снова центрифугируйте при 3000 об/мин в течение 20 мин, собирая фильтрат из внешней пробирки ультрафильтрационной центрифуги. Этот этап повторяют три раза, чтобы отделить неглипсообразующий материал от глипа. Наконец, концентрат GLip во внутренней трубке ультрафильтрационной центрифуги полностью удаляют, а собранный фильтрат полностью перемешивают и хранят при 4 °C в ожидании определения.

 

1 .3 .3 Определение скорости встраивания GLip

Отберите 100 мкл фильтрата из внешней пробирки ультрафильтрационной центрифуги и разбавьте его соответствующим образом. После соответствующего разбавления определяли содержание свободного GSH в фильтрате в соответствии с методом, описанным в п. 1.3.1, и стандартной кривой GSH, а скорость встраивания GSH в GLip рассчитывали согласно уравнению (1).

Скорость встраивания ×100% , (1) где :Wtotal - общее количество GSH, добавленного во время приготовления; Wfree - количество свободного GSH, измеренное.

 

1 .3 .4 Оптимизация параметров процесса

В процессе приготовления ГЛП определяли количество лецитина (100, 150, 200, 250, 300, 350 мг), Tween-80 (40, 60, 80, 100, 120, 140 мг), GSH (30, 40, 50, 60, 70, 80 мг), время соникации (5, 10, 15, 20, 25, 30 мин) и массовое соотношение лецитина и холестерина (1:1, 2:1, 4:1, 6:1, 8:1, 10:1), используя скорость встраивания в качестве индикатора, На основе результатов односторонних экспериментов были разработаны эксперименты по анализу поверхности отклика (RSA) с 17 экспериментальными точками для трех факторов и трех уровней с добавлением лецитина, GSH и Tween-80 в качестве независимых переменных.

 

1 .3 .5 Определение размера частиц GLip

1 мл образца GLip разбавляли в 10 раз сверхчистой водой, затем определяли размер частиц и поверхностный заряд образца с помощью потенциометрического анализатора размера частиц при 20 ℃, а показатель преломления фосфолипидов и дисперсионной среды составлял 1 . 330. Каждый образец измерялся более 3 раз параллельно.

 

1 .3 .6 Обработка и анализ данных

Анализ поверхности отклика проводился с помощью программы Design-Expert V8.0.6. 0.6 для подгонки полиномиального уравнения второго порядка, а коэффициенты уравнения линейной регрессии были проверены на значимость (F-тест) для обобщения влияния выбранных отдельных факторов на скорость инкорпорации GSH в GLip. Полученные полиномиальные уравнения второго порядка были преобразованы в поверхности отклика с помощью программы Design-Expert V8.0.6 для дальнейшего анализа влияния экспериментальных факторов и уровней на скорость встраивания GLip[15] .

 

2 Результаты и обсуждение

2.1 Измерение содержания GSH

Стандартная кривая GSH в соответствии с п. 1.3.1 представлена на рис. 1. Стандартная кривая GSH была построена в соответствии с п. 1.3.1, как показано на рис. 1. Как видно из рис. 1, массовая концентрация GSH показала хорошую линейную зависимость от абсорбции в диапазоне 0~200 мкг/мл, а линейное уравнение составило y = 0,002 1x + 0,004 7 , R2 = 0,999 2 . Массовую концентрацию GSH в образце рассчитывали по стандартной кривой, а затем определяли массу GSH.

 

2.2 Средний размер частиц GLip

Средний размер зерен GLip составил (77,70 ± 0,5 мм). 70 ± 0 . 87) нм, PDI (0. 219 ± 0 .005) и дзета-потенциал (- 27 .20 ± 0 .031) В. Гранулометрический состав этих наноразмерных частиц GLip относительно однороден и стабилен. 2.3 Влияние одностороннего эксперимента на скорость встраивания GLip

 

2.3 . 1 Влияние добавления лецитина на скорость встраивания

Согласно предварительному тестированию, массовое соотношение лецитина и холестерина было установлено на уровне 4:1, количество твина-80 составляло 100 мг, а количество GSH - 70 мг, и было изучено влияние добавления лецитина в количестве 100, 150, 200, 250, 300 и 350 мг на скорость встраивания GLip. Как видно из рис. 2, при количестве добавленного лецитина менее 200 г скорость встраивания GLip была пропорциональна количеству добавленного лецитина, что в основном связано с тем, что увеличение количества лецитина может образовывать больше фосфолипидных бислоев, которые могут инкапсулировать больше GSH, тем самым увеличивая скорость встраивания GLip; при количестве добавленного лецитина 200 г скорость встраивания GLip достигала максимума, который составлял 63%; при количестве добавленного лецитина более 200 г скорость встраивания GLip достигала максимума, который составлял 63%. Когда количество добавленного лецитина превышает 200 г, скорость встраивания GLip практически не меняется, что может быть связано с тем, что фосфолипидный бислой имеет определенный предел для встраивания GSH, и имеет тенденцию к насыщению после достижения максимального количества встраиваемого GSH. Кроме того, в данной работе используется пленочно-ультразвуковой метод приготовления GLip, если добавление лецитина в систему приготовления слишком велико, это приведет к неравномерному образованию пленки после ротационного испарения, и будет сложнее промыть пленку раствором PBS.

 

2.3 .2 Влияние соотношения лецитина и холестерина на скорость инкапсуляции

Фиксированное количество лецитина составляло 200 мг, количество твина-80 - 100 мг, количество GSH - 70 мг, и было исследовано влияние массового соотношения лецитина и холестерина (1:1, 2:1, 4:1, 6:1, 8:1, 10:1) на скорость встраивания GLip. Как показано на рисунке 3, с увеличением соотношения лецитина и холестерина скорость встраивания GLip увеличивалась, а затем уменьшалась, и когда соотношение лецитина и холестерина составило 4:1, скорость встраивания GLip достигла максимума около 55%. Это объясняется тем, что холестерин является одним из видов липидов, который может входить в фосфолипидный бислой и повышать герметичность фосфолипидного бислоя, что делает пленку стабильной и улучшает скорость встраивания Glip. Однако, когда соотношение добавленного лецитина и холестерина превышало 4:1, фосфолипидный бислой становился нестабильным при добавлении холестерина, что приводило к увеличению проницаемости мембраны и даже затрудняло ее формирование, что приводило к экссудации GSH и снижало скорость встраивания Глипа[16] .

 

2.3 .3 Влияние добавления Tween-80 на скорость встраивания

Массовое соотношение лецитина и холестерина было зафиксировано на уровне 4:1, добавление лецитина составило 200 мг, добавление GSH - 70 мг, и было исследовано влияние добавления твина-80 (40, 60, 80, 100, 120, 140 мг) на скорость встраивания GLip. Как показано на рис. 4, с тенденцией добавления твина-80, скорость встраивания GLip достигла максимума около 60% при добавлении твина-80 в количестве 100 мг. Твин-80 - это неионное ПАВ, которое может равномерно распределяться в водной и липидной фазах липосом и инкапсулироваться в липидный бислой, образуя более плотную мембрану и делая структуру фосфолипидного бислоя более стабильной. Поэтому, когда количество твина-80 составляло менее 100 мг, скорость инкапсуляции GLip увеличивалась с увеличением количества твина-80. Было исследовано влияние добавления глутатиона (30, 40, 50, 60, 70, 80 мг) на скорость встраивания GLip. Как показано на рис. 5, с увеличением количества GSH скорость встраивания GLip увеличивалась, а затем уменьшалась, и скорость встраивания GLip достигла максимума около 60% при добавлении 70 мг GSH. Это объясняется тем, что глутатион является водорастворимым препаратом.

 

 Способность проникать в водную фазу внутри фосфолипидного бислоя увеличивает скорость встраивания липосом GSH. Однако объем липосомных везикул ограничен, а количество встраиваемого глутатиона определено[18] . Когда количество добавленного глутатиона превышает 70 мг, объем водной фазы липосом становится насыщенным, и трудно растворить больше глутатиона, что снижает скорость встраивания GLip.

 

2.3 .5 Влияние времени воздействия ультразвука на скорость встраивания

Массовое соотношение лецитина и холестерина было зафиксировано на уровне 4:1, количество добавленного лецитина составляло 200 мг, количество добавленного твина-80 - 100 мг, количество добавленного GSH - 70 мг, и было исследовано влияние времени соникации на скорость встраивания GLip. Как показано на рис. 6, с увеличением времени соникации скорость встраивания GLip увеличивалась, а затем уменьшалась. Когда время соникации составляло 10 мин, скорость встраивания GLip достигала максимума и составляла около 56 %. В процессе приготовления липосом ультразвук обычно используется для передиспергирования частиц в системе, чтобы получить липосомы с малым размером частиц и равномерным распределением, для повышения стабильности системы[19] . Однако, если время воздействия ультразвука слишком велико, эффект ультразвука усиливается, структура липосом разрушается и происходит утечка GSH, что, в свою очередь, снижает скорость встраивания GLip.

 

2.4 Оптимизация параметров подготовки GLip

2.4 . 1 Конструкция Бокса-Бенкена

Исходя из результатов одностороннего эксперимента, очевидно, что изменение добавки лецитина

Максимальная скорость встраивания GLip в зависимости от количества лецитина, GSH и Tween-80 была выше, чем в зависимости от соотношения лецитина и холестерина и времени ультразвука, поэтому были выбраны количества лецитина, GSH и Tween-80.

Результаты трехфакторного, трехуровневого испытания ударной поверхности были разработаны в соответствии с принципом комбинированного экспериментального дизайна центра Бокса-Бекхена, где количество шипа и количество Tween-80 выступали в качестве независимых переменных, а скорость внедрения GLip - в качестве зависимой переменной.

 

2.4 .2 Построение уравнения модели и проверка значимости

Данные, приведенные в таблице 2, были проанализированы с использованием коэффициента встраивания GLip в качестве значения отклика и подогнаны под квадратичное полиномиальное уравнение регрессии, смоделированное как: Y = 63 . 92 + 3.20A + 3. 11B - 0.52C + 2.40AB - 0.75AC + 1 . 54BC - 3.74A2 - 2.28B2 - 1 .64C2 . Результаты проверки значимости коэффициентов уравнения регрессии приведены в таблице 3.

 

Из проверки значимости коэффициентов уравнения регрессии и дисперсионного анализа (ANOVA) видно, что P < 0,000 1 , поэтому модель регрессии поверхности отклика достигает высокозначимого уровня; и поскольку R2 = 0,983 5 , это показывает, что 98% данных могут быть интерпретированы уравнением модели, а P-значение термина out-of-fit составляет 0,160 9 , который является незначимым, что означает, что модель, выбранная в этом эксперименте, подходит для приготовления GLip, а модель квадратичного уравнения регрессии является значимой. Это указывает на то, что модель, выбранная в данном эксперименте, подходит для приготовления GLip, а модель квадратичной регрессии является значимой, поэтому можно получить скорость встраивания липосом и оптимизировать процесс приготовления липосом. Дисперсионный анализ (ANOVA) показал, что A, B, AB, BC, A2, B2 и C2 оказывают значительное влияние на скорость встраивания GLip, а стандартные коэффициенты регрессии влияющих факторов были A > B > C. Коэффициент вариации (CV) квадратичной регрессионной модели составил CV = 1,5. Коэффициент вариации (CV) модели составил 1,40 %, что говорит о том, что разница между прогнозируемыми и экспериментальными значениями была небольшой.

 

2.4 .3 Анализ результатов оптимизации процесса подготовки

Методология поверхности отклика (RSM) - это графическое представление трехмерного контурного графика в двумерной плоскости определенной поверхности отклика (Y) с соответствующими факторами A, B и C. Каждая поверхность отклика анализируется для двух факторов, а другой фактор фиксируется на нулевом уровне. Поскольку график позволяет визуализировать влияние факторов на значения отклика, их взаимодействие при приготовлении GLip можно обнаружить на графиках анализа поверхности отклика, полученных в ходе экспериментов.20 Влияние взаимодействия трех факторов, добавления лецитина, добавления GSH и добавления Tween-80, на скорость встраивания GLip показано на рис. 7 и рис. 9. - Влияние трех факторов на скорость встраивания GLip показано на рис. 7 и рис. 9.

 

Как показано на рис. 7, поверхность отклика имеет более крутой наклон, что свидетельствует о том, что взаимодействие между добавками лецитина и GSH оказывает более значительное влияние на скорость встраивания GLip. Судя по контурным линиям на рис. 7, эллипсы более плотно расположены в области добавления лецитина, что указывает на то, что влияние добавления лецитина на скорость встраивания больше, чем влияние добавления GSH. При неизменном количестве GSH скорость встраивания увеличивалась, а затем уменьшалась с увеличением количества лецитина, и скорость встраивания достигала максимума, когда количество лецитина составляло 225-250 мг. Когда количество добавленного лецитина было постоянным, при увеличении количества GSH скорость встраивания сначала увеличивалась, а затем уменьшалась; когда количество добавленного GSH составляло 75-80 мг, скорость встраивания достигала максимума.

 

Оболочкой липосомы является лецитин, и объем липосомы, образованной определенным количеством лецитина, является определенным, а при добавлении GSH объем липосомы будет перегружен. Как показано на рис. 8, более крутой наклон можно увидеть из графика поверхности отклика, что указывает на то, что взаимодействие между количеством добавленного лецитина и количеством добавленного Tween-80 оказывает более очевидное влияние на скорость встраивания. Из контурных линий на рис. 8 видно, что эллипсы расположены более плотно в области добавления лецитина, что указывает на то, что влияние добавления лецитина на скорость встраивания больше, чем влияние добавления твина-80 на скорость встраивания. При постоянном количестве лецитина скорость встраивания увеличивалась с увеличением количества твина-80, смачиваемость которого сначала увеличивалась, а затем уменьшалась, что облегчало проникновение воды и ускоряло скорость распада; в дополнение к сильной солюбилизации антифлокуляционный эффект увеличивал растворение препарата, что снижало скорость встраивания. При неизменном количестве добавленного Tween-80 скорость встраивания с увеличением количества лецитина сначала увеличивалась, а затем уменьшалась, и самая высокая скорость встраивания была достигнута при добавлении 225-250 мг лецитина.

 

2.4 .4 Валидация оптимальных условий приготовления GLip

Оптимальные параметры для приготовления GLip были проанализированы с помощью статистического программного обеспечения Design-Expert V8.0.6: 232,84 мг лецитина, 75,91 мг GSH и 94,30 мг треонина-80, а прогнозируемая оптимальная степень встраивания составила 66,27%. Для проверки достоверности модели в сочетании с реальной экспериментальной ситуацией оптимальный процесс подготовки был оптимизирован до 232 мг лецитина, 75 мг GSH, 94 мг Tween-80, и скорость встраивания GLip составила (65,85±0,54)% после 3 повторений. 85±0,54)%, а абсолютное значение ошибки от теоретического предсказания составило менее 5%. Это указывает на то, что параметры модели, оптимизированные с помощью методологии поверхности отклика, точны, а оптимальные условия подготовки надежны, что представляет ценность.

 

3 Заключение

В данной работе на основе одностороннего эксперимента, в котором в качестве индикатора используется скорость встраивания, были получены следующие результаты

С помощью метода поверхности отклика были проанализированы взаимодействия между факторами, влияющими на приготовление ГЛП методом тонкопленочного сонирования, и получены оптимальные параметры для приготовления ГЛП, которые улучшили скорость встраивания ГЛП. Оптимальные условия приготовления были следующими: 232 мг лецитина, 75 мг GSH и 94 мг твина-80, а максимальная скорость встраивания составила (65,85±0,54)%. Результаты данной работы служат основой для разработки системы нанодоставки GSH, что может способствовать дальнейшему применению GSH в пищевой и фармацевтической промышленности.

 

Ссылки.

[1] Dai Pangcong, Wu Hui. Исследование прогресса в области применения глутатиона[J] . Современная еда, 2020(21) :40 - 43 .

[2] SIES H .Глутатион и его роль в клеточных функциях[J] .Free Radical Bio Med , 1999 , 27(9/ 10) :916- 921 .

[3] XU Junnan, WANG Jing, CHANG Tingting, et al. Применение восстановленного глутатиона при варке фруктовых вин [J] . China Brewing, 2018 , 37(7) :1 - 5 .

[4]DILOKTHORNSAKUL W , DHIPPAYOM T , DILOKTHORNSAKUL P .Клинический эффект глутатиона на цвет кожи и другие связанные с ним состояния кожи: систематический review [ J] . J Cosmet Dermatol , 2019 , 18(3) :728- 737 .

[5]LV H , ZHEN C , LIU J , et al. Unravelling potential role of gluta- thione in multiple forms of cell death in cancertherapy [J] .Oxid Med Cell Longev , 2019 , 2019 :1 - 16.

[6] mozafari r m . Ультраструктурная архитектура глутатиона, захваченного липосомами: крио-SEM исследование[J] . Cell Mol Biol Lett , 2004 , 9(2) : 101 - 103 .

[7] Du Ge. Исследование технологии микрокапсулирования глутатиона с помощью комбинированной коагуляции[D] . Уси :Цзяннаньский университет, 2015 .

[8]naji-tabasi s , razavi s m a , mehditabar h .  Изготовление наночастиц камеди семян базилика в качестве новой пероральной системы доставки глюта-тиона[J] . Carbohyd Polym , 2017 , 157 :1703 - 1713 .

[9]JOY N , SIMOM J , O 'Carrolls S J et al.  Оптимизация конъюгации глутатиона с липосомами количественно с помощью валидированного анализа ВЭЖХ [J] . Int J Pharm, 2019, 567 :118451 .

[10] HAMMOUD Z , GHARIB R , FOURMENTIN S , et al. Новые данные о встраивании компонентов эфирных масел в липосомы, состоящие из липоида S100 и холестерина [J] . холестерина[ J] . Int J Pharm, 2019, 561 :161 - 170.

[11] Yang W-S. Исследование и применение активной липосомной доставки лекарств[J] . Современная медицина и здоровье, 2011 , 27(17) :2647- 2648 .

[12] Ju Yali, He R, Liu Guoqin. Исследование получения водорастворимых лекарственных липосом методом стеклянных микросфер[J] . Обработка зерна, 2013 , 38(4) :35- 38.

[13] Zhao XD, Wei DZ, Wan Q, et al. Простой метод определения глутатиона[J] . Журнал фармацевтического анализа, 2000(1) :34- 37 .

[14] LASICD D . Липосомы : от физики до применения[M] . Amster- dam:Elsevier , 1993 :575 .

[15] Zhao S.S., Wang Z.Y.. Методология поверхности отклика для оптимизации процесса приготовления антоциановых липосом из черной смородины[J] . Наука и технология пищевой промышленности, 2012 , 33(23) :258- 262.

[16] LIN Qi, ZHANG Jiaying, WU Zhenchen, et al. Оптимизация процесса приготовления и трансдермальный эксперимент in vitro гибких нанолипосом эллаговой кислоты[J] . Journal of Huaqiao University (Natural Science Edition), 2020, 41(5) :638- 646.

[17] XU Luan, YAO Huiyuan. Исследование механизма взаимодействия между Tween- 80 и липосомной мембраной[J] . Journal of Xi'an Petroleum University (Natural Science Edition), 2005, 20(6) :45- 48.

[18]LU Q , LI D C , JIANG J G. Приготовление системы чайного полифенолнаноли-посома и ее физико-химические свойства[J] . J Agr Food Chem, 2011, 59(24) :13004- 13011 .

[19]HUANG S M , KUO C H , CHEN C A , et al. RSM и ANN модель-основанный оптимизационный подход для разработки липосом с ультразвуковым сопровождением инкапсуляции пицеида с помощью ультразвука[J] .  Ultrason Sonochem, 2016, 36 :112.

[20] CHEN Jian, SUN Aidong, GAO Xuejuan, et al. Оптимизация ультразвуковой экстракции проантоцианидинов ореха бетеля с помощью анализа поверхности отклика[J] . Food Science, 2011 , 32(4) :82- 86.