Как отбирать и разводить штаммы, продуцирующие глутатион

 Аннотация：Ультрафиолетовый свет и нитрозогуанидин были использованы для мутагенизации уходящего штамма SIPI-G0619, а в качестве моделей для скрининга были использованы три устойчивости - этионин, хлорид цинка и триазол, и в итоге был получен стабильный штамм SIPI-Gh435 с высоким выходом глутатиона; выход глутатиона составил 864 мг/л, что в 4,9 раза выше, чем у уходящего штамма.

 

Глутатион (1), трипептид, образующийся в результате конденсации глутаминовой кислоты, цистеина и глицина, является основным антиоксидантом в живых организмах и играет ключевую роль в поддержании подходящей окислительно-восстановительной среды[1] . Сульфгидрильные группы в молекулах глутатиона могут конкурентно связываться с оксидами, тем самым защищая сульфгидрильные группы функциональных белков в организмах, а также могут связываться с ионами тяжелых металлов, таких как Pb2+ и As3+, предотвращая денатурацию белков[2] и играя детоксицирующую роль. В то же время он обладает антирадиационным и антивозрастным действием [3,4].

 

Глутатион может быть получен путем экстракции, химического синтеза и ферментации, среди которых ферментация является основным методом производства [5]. Однако уровень ферментации 1 в Китае недостаточно высок для промышленного производства. Поэтому особенно важно получить высокопродуктивный штамм 1 и как можно скорее начать его промышленное производство. В данном исследовании мы использовали ультрафиолетовый свет и нитрозогуанидин для мутации исходного штамма SIPI-G0619, в то же время мы использовали этионин, хлорид цинка и триазол в качестве скрининговых моделей, и, наконец, мы получили генетически стабильный высокопродуктивный штамм 1 SIPI-Gh435, с ферментационной способностью 864 мг/л, что в 4,9 раза выше, чем у исходного штамма.

 

1 Инструменты и материалы

1.1 Инструменты и реагенты

Высокоэффективный жидкостный хроматограф модели 2 9 9 6 (Water s Company); центрифуга Allegra TM X-22R (ротор F0850) (Beckman coulter).

Этионин (Sigma); все остальные реагенты были аналитически чистыми.

 

1.2 Штамм и среда

Штамм отправления: Прион-продуцирующие дрожжи (Candida u til is) SIPI-G0619 (в нашей коллекции).

Среда для выращивания слаттеров и пластин/г-л-1: дрожжевой экстракт 3,0, глюкоза 20, пептон 15, агар 22; pH естественный.

Среда для посевных колб/г-Л-1: глюкоза 20, дрожжевой экстракт 10, пептон 10; 20 мл/250 мл; pH 5,5.

Среда для ферментации/г - L-1 : глюкоза 40, дрожжевой экстракт 2,0, (NH4)2SO4 12, K2SO4 3,0, MgSO4-7H2O 1,0, MnSO4-H2O 0,01, FeSO4-7H2O 0,01; pH 5,5; загрузка 30мл/250мл.

 

2 Методология и результаты

2.1 Методы определения культуры и содержания

Метод посевного культивирования: отберите кольцо организмов с активированного слоя в посевную среду и инкубируйте при температуре 30℃ с колебаниями (220 об/мин) в течение 24 ч.

Метод ферментационной культуры: семена культивировали в течение 24 часов, 5% инокулята добавляли в ферментационную среду и культивировали при температуре 30℃ с колебаниями (220 об/мин) в течение 32 часов.

Определение содержания: 1 для внутриклеточного продукта. Ферментационный бульон центрифугировали (10000 об/мин) в течение 4 мин, а полученную бактерию экстрагировали 2%-ной серной кислотой в течение 2 ч. Содержание 1 определяли методом ВЭЖХ [6].

 

2.2 Методы мутагенеза

УФ-мутагенез: бактериальную суспензию исходного штамма SIPI-G0619 облучали УФ-светом (30 Вт, расстояние 30 см, 33 об/мин) в течение определенного времени, а затем наносили на пластины со средой для подсчета количества жизнеспособных организмов и летального исхода (табл. 1).

 

Нитрозогуанидин (NTG) мутагенез: В асептических условиях добавьте 0,1 мл 50 мг/мл NTG в центрифужную пробирку, содержащую 5,0 мл бактериальной суспензии, и поставьте ее на шейкер при 28℃. Центрифугируйте (10 000 об/мин) в течение 10 минут и промойте осажденные организмы 0,85%-ным физиологическим раствором в течение 3 раз, затем сделайте бактериальную суспензию, содержащую физиологический раствор, и нанесите ее на пластины для подсчета количества жизнеспособных организмов и летальности (табл. 1).

Таблица 1 Летальность штаммов после УФ-облучения и обработки НТГ в разное время

мутаген	Время/мин	Количество живых бактерий/шт/мл-1	Коэффициент летальности/процент
УФ	0	3.0 x 106
	0.25	1.6 x 106	47
	0.5	6.0 x 104	98
	0.75	7.0 x 102	>99
Роль NTG	0	6.0 x 106	—
	30	2.5 x 106	58
	50	6.0 x 104	99
	80	4.0 x 102	>99

 

Исходя из опыта, в качестве условий УФ-мутагенеза было выбрано 3 0 с воздействия, а в качестве условий НТГ-мутагенеза - 50 мин воздействия.

 

2.3 Методы скрининга

2.3.1 Летальность скринеров устойчивости против штамма вылета

Этионин: является структурным аналогом 1 и может по обратной связи ингибировать биосинтез 1. При увеличении концентрации этионина смертность организма повышается из-за недостатка 1 (табл. 2).

 

Хлорид цинка: высокие внутриклеточные концентрации Zn2+ могут деформировать и инактивировать активный центр глутатионредуктазы [7], тем самым подавляя синтез восстановленного глутатиона. Zn2+ является необходимым микроэлементом для роста дрожжей, а также ионом тяжелого металла, который может способствовать росту дрожжей при низкой концентрации, но подавлять активность многих ферментов при высокой концентрации, что приводит к повышению уровня смертности дрожжей (табл. 2).

 

1,2,4-триазол: Согласно литературным данным [8], устойчивые к триазолу мутантные штаммы обладают высокой способностью к синтезу 1. Однако высокие концентрации триазола оказывали ингибирующее действие на рост клеток, а смертность дрожжей возрастала с увеличением концентрации триазола (табл. 2).

 

Таблица 2 Летальность штаммов при использовании различных концентраций этионина, хлорида цинка и триазола.

резистивный экран	Концентрация/мг-мл-1	6Жизнеспособные бактерии/10 -мл-1	Коэффициент летальности/процент
Этионин (ЭТ), незаменимая аминокислота	0	5.2	—
	0.06	4.3	17
	0.1	3.3	37
	0.3	1.3	75
хлорид цинка	0	5.2
	0.5	3.4	35
	1.0	1.8	65
	2.0	0.19	96
триазол (химия)	0	5.2	—
	0.1	4.7	9.6
	0.5	3.9	25
	1.0	0.3	42

 

Летальность (степень ингибирования) смешанного скрининга устойчивости к исходному штамму составляла 7,8%, когда смесь содержала 0,1 мг/мл этионина, 1,0 мг/мл хлорида цинка и 0,5 мг/мл триазола; и 95%, когда смесь содержала 0,3 мг/мл этионина, 2,0 мг/мл хлорида цинка и 1,0 мг/мл триазола. Когда проверочная смесь содержала 0,3 мг/мл этионина, 2,0 мг/мл хлорида цинка и 1,0 мг/мл триазола, летальность (ингибирование) исходного штамма составляла 95 %.

 

2.3.2 Создание модели скрининга высокопродуктивных штаммов и скрининг

Большинство мутантных штаммов погибло из-за ингибирования синтеза 1 при внесении их на пластины, содержащие три экрана устойчивости: этионин, хлорид цинка и триазол. Только мутантные штаммы с вышеуказанным ингибированием могли расти на пластинах, содержащих высокие концентрации экранов устойчивости, и, вероятно, были наиболее продуктивными штаммами.

 

2.3.2.1 Скрининг УФ-мутагенеза

Исходный штамм SIPI-G0619 облучали УФ-светом в течение 30 с. Мутагенный бактериальный раствор был нанесен на скрининговую пластину, содержащую этионин 0,1 мг/мл, хлорид цинка 1,0 мг/мл и триазол 0,5 мг/мл, и инкубирован при 28℃ в течение 2 дней.

В общей сложности 620 одиночных колоний были отобраны для прохождения через косой срез и просеяны партиями. Потенциал ферментации у уходящего штамма составил 176,3 мг/л, из которых потенция ферментации была в 1,2 раза выше, чем у уходящего штамма. Потенция ферментации составила 176,3 мг/л, из которых потенция ферментации была более чем в 1,2 раза выше, чем у исходного штамма, что составило более 60 %. Всего было отобрано 18 штаммов с выходом в 2,3 раза и более по сравнению с исходным штаммом. После отбора был получен высокопродуктивный штамм SIPI-Gr232 с ферментативной активностью 475 мг/л, что в 2,7 раза выше, чем у SIPI-G0619. Этот штамм был использован в качестве исходного для следующего этапа NTG-мутагенеза.

 

2.3.2.2 Скрининг мутагенеза NTG

Штамм SIP I -Gr 2 3 2 обрабатывали NT G в течение 5 0 мин. Мутагенизированный бактериальный раствор наносили на скрининговые пластины, содержащие этионин 0 . 3 мг/мл, хлорид цинка 2,0 мг/мл и триазол 1,0 мг/мл.

530 одиночных колоний были отобраны для прохождения через слант и просеяны партиями. Более 45% штаммов имели эффективность ферментации более чем в 1,2 раза выше, чем у SIPI-Gr232. Эффективность ферментации SIPI-Gh435 составляла 864 мг/л, что в 1,8 раза превышало SIPI-Gr232 и в 4,9 раза SIPI-G0619, а эффективность ферментации SIPI-Gh435 составляла 864 мг/л, что в 1,8 раза превышало SIPI-Gr232 и в 4,9 раза SIPI-G0619.

 

2.4 Исследование стабильности высокоурожайного мутантного штамма SIPI-Gh435

Продуктивность SIPI-Gh435 незначительно снизилась со 100% до 94% после 4 последовательных поколений и уменьшилась до 83% и 72% после F5 и F6. Это указывает на то, что штамм SIPI-Gh435 генетически стабилен.

 

3 Обсуждение

В [9] устойчивый мутантный штамм с выходом 180 мг/л был получен путем УФ-мутагенеза и скрининга на устойчивость к этионину, а в [10] высокопродуктивный штамм 1 с выходом 339,1 мг/л был получен путем мутагенеза с УФ и нитрозогуанидином и скрининга на устойчивость к этионину и азолу. Однако метод добавления трех устойчивостей, а именно этионина, ZnCl2 и азола, на пластину в качестве условий скрининга еще не был описан. Однако об одновременном добавлении этионина, хлорида цинка и триазола на пластину для скрининга в качестве условия скрининга не сообщалось. Используя эту модель, был получен стабильный высокоурожайный мутант устойчивости 1, SIP I - Gh435, с выходом 864 мг/л, что значительно превышало выход 1 в вышеупомянутом отчете.

 

Ссылки:

[1] Демопулос ХБ, Селигман МЛ. Фармацевтические препараты глутатиона и методы их применения: США, 6586404 [П]. 2003-07-01.

[2] Grant CM . Роль систем глутатиона/глутаредоксина и тиоредоксина в росте дрожжей и ответе на стрессовые условия[J]. Mol Microbiol, 2001, 39(3): 533-541.

[3] Cha JY, Park TC, Jeon BS, et al. Оптимальные условия ферментации для увеличения производства глютатидина Saccharomyces cerevisiae FF-8[J]. J Microbiol, 2004, 42(1): 51-55.

[4] Sun Hong-Gang, Lu Yi-Zhen.  Метаболизм и применение глутатиона[J]. Образование в области здравоохранения, 2004, 22(10):126.

[5] ZHOU Yuguang, FU Guoping, XIAO Zaijun. Прогресс в производстве и применении глутатиона [J]. Наука и технология пищевой промышленности, 2003, 24(3): 89-91.

[6] ZHANG Lirong, WANG Zhigang, XIE Qingjiao. Определение восстановленного глутатиона для инъекций методом ВЭЖХ[J]. Qilu Pharmaceutical Affairs, 2005, 24(2): 93-94.

[7] JIA Jianping, QIU Juanping. Селекция и разведение штаммов с высоким содержанием глутатиона[J]. Микробиологический циркуляр, 2003, 30(4): 24-29.

[8] Хамада С, Танака Х, Сакато К. Процесс получения глутатиона: США, 4582801 [П]. 1986-04-15.

[9] HU Linhua, TAN Tianwei. Выбор высокопродуктивных глутатионовых дрожжевых штаммов и предварительное исследование условий культивирования[J]. Журнал химической инженерии в высшем образовании, 2005, 19(2): 273-276.

[10] TONG Qunyi, CHEN Jian, LI Huazhong. Выбор дрожжей для высокого производства глутатиона и условия их культивирования[J]. Промышленная микробиология, 2002, 32(2): 13-17.