Аннотация: Цель исследования - изучить влияние различных концентраций глутатиона (GSH) на окислительный стресс в хранящихся эритроцитах (ХЭК). Методы 12 мл каждого из 6 свежеприготовленных sRBC были разделены на 4 группы: группа ACD, группа GSH1, группа GSH2 и группа GSH3, по 3 мл в каждой группе. В группу ACD добавляли 1 мл консервирующего раствора ACD-B, затем 50 мкл физиологического раствора. В группы GSH1, GSH2 и GSH3 добавляли по 1 мл консервирующего раствора ACD-B.
.jpg)
По сравнению с группой ACD, содержание АТФ и активность фермента GSH-PX были значительно выше в группах GSH2 и GSH3 в дни 1, 7, 14 и 21 (P<0,05), а содержание АТФ и активность фермента GSH-PX были значительно выше в группах GSH2 и GSH3 по сравнению с группой GSH1 (P<0,05). По сравнению с группой ACD активность фермента SOD была значительно выше в группе GSH2 в дни 1, 7, 14 и 21 (P<0,05) и в группе GSH3 в дни 1, 7 и 14 (P<0,05); по сравнению с группой GSH1 активность фермента SOD в группе GSH2 и группе GSH3 на 21 день была значительно выше (P<0,05). По сравнению с группой ACD, содержание МДА в группах GSH2 и GSH3 было значительно ниже на 1, 7, 14 и 21 день (P<0,05); по сравнению с группой GSH1, содержание МДА в группах GSH2 и GSH3 было значительно ниже на 1, 7 и 21 день (P<0,05). Был сделан вывод, что добавление 62,5 и 125 мкмоль/л глутатиона к sRBCs оказывает определенное антиокислительное действие и может уменьшить повреждение при хранении sRBCs.
Хранящиеся эритроциты (sRBC) подвергаются повреждениям при хранении, которые увеличиваются с течением времени в процессе хранения. Изменения при повреждении при хранении касаются не только метаболического уровня, но и окислительно-восстановительного гомеостаза и цитоскелетных изменений[1-2] . В рамках изучения вопроса о смягчении повреждений при хранении наша исследовательская группа провела более глубокие исследования по повышению энергообеспеченности[3-4] . Снижение уровня глутатиона (GSH) может быть одним из важных механизмов, приводящих к повреждению СКВ[5] . GSH может снизить окислительный стресс СКВ и уменьшить повреждение СКВ. В этом эксперименте мы добавили различные концентрации GSH в резус-палочки и наблюдали за изменениями показателей, связанных с резус-палочками, после хранения в течение разного времени, чтобы исследовать эффект GSH против окислительного стресса в процессе хранения резус-палочек.
Материалы и методы
экспериментальная клетка
Данное исследование было одобрено Комитетом по этике больницы (KLLY-2019-028). Отделение переливания крови предоставило 6 порций (по 200 мл) свежих делетированных эритроцитов от заготовки до клинического применения, из каждой порции было отобрано 12 мл, а оставшаяся часть хранилась для дальнейшего использования.
Группировка и обработка 12 мл sRBC были разделены на четыре группы: группа кислотно-цитратно-декстрозная (ACD), группа GSH1, группа GSH2 и группа GSH3, по 3 мл в каждой группе, на асептическом операционном столе. В этом эксперименте градиент концентрации раствора GSH составлял 12,5, 62,5 и 125 мкмоль/л, соответственно, в соответствии с методом литературы [6]. В группу ACD добавляли 1 мл консервирующего раствора ACD-B, затем 50 мкл физиологического солевого раствора, в группы GSH1, GSH2 и GSH3 добавляли 1 мл консервирующего раствора ACD-B, а в группы GSH1, GSH2 и GSH3 добавляли растворы GSH в концентрации 12,5, 62,5 и 125 мкмоль/л, соответственно. Раствор GSH в концентрациях 12,5, 62,5 и 125 мкмоль/л добавляли к sRBCs групп GSH1, GSH2 и GSH3, а затем к ним добавляли 50 мкл раствора GSH. Эритроциты четырех групп хранились в холодильнике при температуре 4 ℃.
Метод ИФА: 100 мкл sRBC помещали в стерильную центрифужную пробирку на 1, 7, 14 и 21 день хранения, а надосадочную жидкость центрифугировали при 10 000×g в течение 10 мин при 4 ℃. Содержание аденозинтрифосфата (АТФ) в sRBC определяли в соответствии с инструкцией к набору реагентов (№ партии: BC0305). Содержание аденозинтрифосфата (АТФ) в sRBC измеряли в соответствии с инструкцией к набору (BC0305). На 1, 7, 14 и 21 день хранения брали 20 мкл sRBC, добавляли 1 мл дистиллированной воды для разбавления крови до раствора 1:49, раствор перемешивали при легком встряхивании и вибрации, а затем оставляли на 5 мин, пока кровь не становилась полностью прозрачной для света. Активность глутатионпероксидазы sRBC (GSH-PX) определяли в соответствии с инструкцией к набору (№ партии A005-1). Все образцы размораживали один раз, каждый образец измеряли 4 раза и брали среднее значение.
Анализ на ксантиноксидазу: 50 мкл sRBC брали на 1, 7, 14 и 21 день хранения, добавляли 1 мл физраствора, центрифугировали при 500~1000×g в течение 10 мин, а супернатант аспирировали микропипеткой, чтобы оставить осажденные sRBC. Возьмите осажденный sRBC после центрифугирования и добавьте в 4 раза больший объем sRBC к дистиллированной воде (200 мкл) и перемешивайте в вихревом миксере в течение 1 мин, чтобы полностью лизировать клетки. Добавьте 0,1 мл безводного этанола к лизату sRBC и тщательно перемешивайте на вихревой мешалке в течение 30 с, затем добавьте 0,1 мл трихлорметана, перемешивайте на вихревой мешалке в течение 1 мин и центрифугируйте клетки при 3500×g в течение 8 мин. В это время жидкость разделялась на три слоя, верхний слой представлял собой раствор для выделения супероксиддисмутазы (SOD), используемый для анализа. Анализ проводили в соответствии с инструкцией к набору (№ лота A001-1). Измерения повторяли 4 раза для каждого образца и брали среднее значение.
Колориметрический анализ на тиобарбитуровую кислоту: 150 мкл sRBC брали на 1, 7, 14 и 21 день хранения, добавляли 2-3 мл физиологического раствора, центрифугировали при 3000×g в течение 10 минут и аспирировали супернатант микропипеткой для удаления осажденной sRBC. Возьмите осажденный sRBC после центрифугирования и добавьте к дистиллированной воде (600 мкл) в 4 раза больший объем sRBC, перемешивайте в течение 1 мин на вихревом миксере, чтобы полностью лизировать клетки. Добавьте 0,3 мл безводного этанола к лизату sRBC и тщательно перемешивайте в вихревой мешалке в течение 30 с. Добавьте 0,3 мл трихлорметана и перемешивайте в вихревой мешалке в течение 1 мин. Центрифугируйте клетки при 3 500×g в течение 10 мин, затем разделите жидкость на три слоя. Анализ проводили в соответствии с инструкцией к набору (Lot No. A003-1). Измерения повторяли 4 раза для каждого образца и усредняли.
Статистический анализ проводили с помощью программы SPSS 18.0, графики строили с помощью программы Graphpad Prism 8.0. Нормально распределенные показатели выражались как среднее±стандартное отклонение (±s), а сравнение между группами проводилось с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями (ANOVA). p<0,05 считалось статистически значимым.
Результаты
Содержание АТФ Содержание АТФ в группах GSH2 и GSH3 в дни 1, 7, 14 и 21 было значительно выше (P<0,05) по сравнению с группой ACD. По сравнению с группой GSH1, уровень АТФ в группах GSH2 и GSH3 был значительно выше (P<0,05) (табл. 1).
Активность GSH-PX Активность GSH-PX была значительно выше в группах GSH2 и GSH3 в дни 1, 7, 14 и 21 по сравнению с группой ACD (P<0,05). Активность GSH-PX была значительно выше в группах GSH2 и GSH3 по сравнению с группой GSH1 (P<0,05) (табл. 2).
Активность СОД была значительно выше в группе GSH2 на 1, 7, 14 и 21 день по сравнению с группой ACD (P < 0,05), а в группе GSH3 - на 1, 7 и 14 день (P < 0,05). Активность СОД была значительно выше в группах GSH2 и GSH3 на 21-й день (P < 0,05) по сравнению с группой GSH1 (табл. 3).
Содержание МДА Содержание МДА в группах GSH2 и GSH3 было значительно ниже (P<0,05) по сравнению с группой ACD в дни 1, 7, 14 и 21 (табл. 4). По сравнению с группой GSH1, уровень МДА в группах GSH2 и GSH3 был значительно ниже (P<0,05) в дни 1, 7 и 21 (табл. 4).
обсуждение
СРБК - наиболее используемый в клинике препарат крови, и качество СРБК тесно связано с различными осложнениями при переливании [7-8]. Качество раствора для консервации СРБК улучшалось и совершенствовалось, и роль АКД, который в настоящее время широко используется в клинике в качестве раствора для консервации, заключается в основном в поддержании структуры и функции СРБК, но он все еще не может избежать возникновения метаболических нарушений, окислительного стресса и других реакций, которые приводят к повреждению СРБК, хранящихся в течение периода хранения. Однако он не может предотвратить нарушения метаболизма, окислительный стресс и другие реакции во время хранения sRBC, которые приводят к повреждению sRBC при хранении. Окислительный стресс является важной причиной повреждения эритроцитов при хранении[9-10] . В здоровых эритроцитах окислительное повреждение может быть в определенной степени смягчено антиоксидантной системой, которая состоит из антиоксидантных соединений, таких как GSH, витамин Е, витамин С, и ферментов (GSH-PX, каталаза и СОД)[11] . Среди них восстановленный GSH является наиболее распространенным природным антиоксидантом, присутствующим в клетках человека[11-12] .
GSH - это трипептид (γ-глутамил-L-цистеин-глицилглицин), который в организме имеет две формы: восстановленный GSH и окисленный GSSG, причем в физиологических условиях восстановленный GSH составляет большую часть. Восстановленный GSH может напрямую соединяться с окислителями, такими как перекись водорода, с образованием воды и окисленного GSSG, а также восстанавливать метгемоглобин до гемоглобина, поддерживая стабильность мембран эритроцитов, и эритроциты с более высоким содержанием GSH меньше страдают от окислительного стресса во время хранения. Чем выше содержание GSH, тем меньше повреждение эритроцитов окислительным стрессом во время хранения. Поэтому добавление GSH в раствор ACD для хранения эритроцитов может помочь уменьшить повреждение эритроцитов во время хранения. В данном эксперименте концентрация и объем жидкости ACD строго соответствовали стандартам хранения sRBC в банках крови, а приготовление раствора GSH было основано на методе из литературы [6], в котором были приготовлены растворы GSH с градиентами концентрации 12,5, 62,5 и 125 мкмоль/л соответственно.
Типичным повреждением при хранении sRBC является снижение уровня внутриклеточного АТФ, уменьшение GSH и увеличение GSSG[13] . АТФ является поставщиком внутриклеточной энергии, и снижение его содержания серьезно влияет на нормальную активность и функцию эритроцитов[14] , и результаты повреждения при хранении sRBC путем добавления различных концентраций GSH показали, что содержание АТФ было выше при добавлении GSH к sRBC с концентрациями 62,5 и 125 мкмоль/л, чем при добавлении 12,5 мкмоль/л GSH, что говорит о том, что добавление 62,5 и 125 мкмоль/л GSH в раствор для хранения ACD-B увеличивает содержание АТФ. Результаты показали, что в то же время добавление GSH в концентрациях 62,5 и 125 мкмоль/л привело к увеличению содержания АТФ по сравнению с 12,5 мкмоль/л. Это позволяет предположить, что добавление 62,5 и 125 мкмоль/л GSH в раствор для хранения ACD-B может замедлить тенденцию к снижению содержания АТФ, увеличить антиоксидантную способность sRBCs, ослабить окислительный стресс клеток и уменьшить повреждение эритроцитов при хранении.
GSH-PX - один из важнейших антиоксидантов в организме, который может блокировать дальнейшее повреждение, вызванное реактивными радикалами кислорода, действовать как селеноцистеин и разлагать перекиси липидов в организме, используя GSH в качестве восстановителя, чтобы предотвратить повреждение клеточных мембран и других биологических тканей в результате перекисного окисления[15] . Результаты настоящего исследования показали, что активности GSH-PX и SOD были выше в sRBCs с концентрацией GSH 62,5 и 125 мкмоль/л, чем в GSH с концентрацией 12,5 мкмоль/л в то же время. В то же время активность GSH-PX и SOD была выше в sRBCs, чем в sRBCs с концентрацией GSH 12,5 мкмоль/л. При добавлении GSH в концентрациях 62,5 и 125 мкмоль/л в раствор для хранения ACD-B показатели АТФ, GSH-PX, SOD и MDA значительно улучшались, что позволяет предположить, что добавление определенной концентрации GSH в раствор для хранения ACD-B может облегчить перекисное повреждение клеточной мембраны, и дополнительно подтверждает, что GSH играет антиоксидантную роль в сохранении эритроцитов.
В организме человека свободные радикалы воздействуют на липиды, вызывая реакцию перекисного окисления, и конечным продуктом окисления является МДА. При добавлении различных концентраций GSH к sRBCs результаты показали, что в то же время содержание МДА в GSH, добавленном в концентрации 62,5 и 125 мкмоль/л, было ниже, чем в 12,5 мкмоль/л. Это говорит о том, что добавление GSH в концентрации 62,5 и 125 мкмоль/л к консерванту ACD-B может замедлить тенденцию к росту МДА и улучшить способность sRBCs к поглощению свободных радикалов. Предполагается, что добавление GSH в концентрациях 62,5 и 125 мкмоль/л в раствор для хранения ACD-B может замедлить рост МДА и улучшить способность sRBCs к поглощению свободных радикалов.
Результаты данного экспериментального исследования показали, что добавление определенных концентраций GSH (62,5, 125 мкмоль/л) в консервирующий раствор ACD-B может уменьшить повреждение при хранении sRBCs. Однако в данном экспериментальном исследовании сравнивалось только влияние трех концентраций GSH на sRBCs, и оптимальная концентрация GSH для сохранения sRBCs нуждается в дальнейшем изучении. Кроме того, в данном экспериментальном исследовании не было отмечено влияния GSH на морфологию и функцию sRBCs, что требует дальнейшего изучения.
В заключение следует отметить, что в течение периода хранения эритроцитов, законсервированных в растворе ACD-B, содержание АТФ, активность ферментов GSH-PX и SOD в эритроцитах снижались, а уровень МДА постепенно увеличивался с увеличением времени. Добавление соответствующих концентраций антиоксидантов в раствор для консервации sRBC может улучшить качество консервации эритроцитов и уменьшить повреждение sRBC при хранении.
Ссылки:
[1] Yoshida T , Prudent M , D'alessandro A . Поражение при хранении эритроцитов: причины и возможные клинические последствия . Blood Trans- fus , 2019 , 17(1) : 27-52.
[2] Bardyn M , Tissot JD , Prudent M . Окислительный стресс и антиокси-дантная защита при переработке крови и хранении концентратов эритроцитов . Transfus Clin Biol , 2018 , 25(1) : 96-100.
[3] Liao XY , Zuo SS , Meng WT , et al. Интраоперационное спасение крови может сократить продолжительность жизни эритроцитов в течение 3 дней после операции: пилотное исследование. Medicine ( Baltimore ), 2017 , 96 (39) : e8143 .
[4] Liao X , Du K , Zhang J , et al. Red blood cells are damaged by intraoperative blood salvage via Ca(2+)-dependent and -inde- pendent mechanisms . Life Sci, 2019, 227: 114-121.
[5] Dumont LJ , Yoshida T , AuBuchon JP . Анаэробное хранение эритроцитов в новом растворе с добавками улучшает восстановление in vivo. Переливание крови, 2009 , 49(3) : 458-464 .
[6] Yang Kun, Wang Hong, Sang Peipei, et al. Предварительное сравнение витамина С и азота-ацетилцистеина в ингибировании окислительного стрессового повреждения во взвешенных эритроцитах. Chinese Blood Transfusion Journal, 2017 , 30(1) : 22-27 .
[7] Amen F , Machin A , Touriño C , et al. N-acetylcysteine improves quality of red blood cells stored for transfusion. Arch Biochem Biophys , 2017 , 621 . 31-37 .
[8] García-Roa M , Del Carmen Vicente-Ayuso M , Bobes AM , et al. Red blood cell storage time and transfusion: current practice, concerns and future perspectives . перспективы . Blood Transfus , 2017 , 15(3) : 222-231 .
[9] Kim J , Nguyen T , Li Y , et al. Противоположные эффекты хранящихся алло-генных эритроцитов и их супернатантов на проницаемость и воспалительную на проницаемость и воспалительные реакции в легочных эндотелиальных клетках человека. AmJ Physiol Lung Cell Mol Physiol , 2020 , 318(3) : L533-L548 .
[10] Wang Y, Li Q, Ma T, et al. Трансфузия старых эритроцитов повышает риск острого повреждения почек после ортотопической трансплантации печени: анализ коэффициента склонности . propensity score analysis . Anesth Analg , 2018 , 127(1) : 202-209 .
[11] Muralidharan M , Mitra A , Maity D , et al. Structural analysis of glutathionyl hemoglobin using native mass spectrometry. J Struct Biol , 2019 , 208(3) : 107386.
[12] Harris IS , Treloar AE , Inoue S , et al. Glutathione and thioredoxin antioxidant pathways synergise to drive cancer initiation and progression. Cancer Cell, 2015, 27(2) : 211-222.
[13] Flatt JF , Bawazir WM , Bruce LJ. Участие утечек катионов в поражении эритроцитов при хранении . Front Physiol, 2014, 5 : 214.
[14] Yamaguchi T , Fukuzaki S . Влияние АТФ на реакцию мембраны эритроцитов человека на высокое давление . Biophys Physicobiol, 2019, 16: 158-166.
[15] Patgiri A , Skinner OS , Miyazaki Y , et al. Инженерный фермент, который нацелен на циркулирующий лактат, чтобы облегчить внутриклеточный дисбаланс NADH :NAD(+) . Nat Biotechnol , 2020 , 38(3) : 309-313 .
评论
发表评论