Влияние глутатиона на рост и устойчивость к высокотемпературному стрессу у раков (Litopenaeus vannamei)

 Procambarus clarkii, широко известный как рак, является самой крупной пресноводной креветкой, разводимой в Китае, с площадью более 1,28 миллиона гектаров в 2019 году, общим объемом производства 2,0896 миллиона тонн и общей стоимостью экономической продукции 411 миллиардов юаней[1] .

 

В процессе выращивания и транспортировки раки подвергаются воздействию различных стрессовых факторов, таких как температура воды, соленость, растворенный кислород, аммиак, рН, нитриты и загрязнение воды [2]. Среди них наиболее распространенным и вредным является высокотемпературный стресс. Оптимальная температура роста раков составляет 21 ~ 28 ℃ [3], результаты предыдущих исследований показывают, что температура воды выше 30 ℃ может вызвать стресс у раков, что приводит к физиологическим нарушениям в организме раков [4], что приводит к значительному снижению их иммунитета и устойчивости к заболеваниям [5]. Как избежать или смягчить негативные последствия высокотемпературного стресса и повысить стрессоустойчивость раков - актуальная проблема.

 

Глутатион, то есть γ-L-глутамил-L-цистеинилглицин (GSH), - биологически активное трипептидное соединение с γ-глутамильной и сульфгидрильной группами, образующееся в результате пептидной конденсации L-глутаминовой кислоты, L-цистеина и глицина, и являющееся природным антиоксидантом. Глутатион - это природный антиоксидант, который может повышать иммунную и антиоксидантную способность животных[6] . Глутатион существует в природе в виде восстановленного глутатиона (GSH) и окисленного глутатиона (GSSG), причем основным действующим веществом является восстановленный глутатион, поэтому глутатион обычно называют восстановленным глутатионом[7] . GSH является уникальным субстратом для глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы в клетках, и он может способствовать синтезу этих двух веществ для поглощения перекисей и радикалов кислорода. GSH - уникальный субстрат для глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы в клетке, который может способствовать синтезу обеих и удалять перекиси и кислородные радикалы для поддержания нормальной физиологической функции клетки[8] . Цель данного эксперимента заключалась в оценке влияния GSH на устойчивость раков к высокотемпературному стрессу и их рост, а также в создании теоретической основы для промышленного применения.

 

1 Материалы и методы

1.1 Экспериментальные материалы

Раки были получены с экспериментальной базы Научно-исследовательского института рыбного хозяйства реки Янцзы на озере Лянцзы. Для эксперимента были отобраны здоровые, энергичные и однородные раки с начальной массой тела (7,74 ± 0,5) г. Восстановленный глутатион был приобретен у Shanghai Yuanye Biotechnology Co.

 

1.2 Селекционные эксперименты

Эксперимент по культивированию был разделен на 6 групп, включая 5 групп с добавками и 1 группу пустого контроля, по 3 параллельные группы с 30 раками в каждой параллельной группе. Пустую контрольную группу кормили коммерческим кормом (без GSH), а группу с добавками - 0,06, 0,12, 0,18, 0,24, 0,3 г/кг GSH в коммерческом корме. Экспериментальные креветки были скормлены в количестве 5,0% от массы тела после 1 недели временного выращивания. Креветок кормили один раз в день в 8:00~8:30 и 19:00~19:30, и выращивали в местной речной воде, с круглосуточным непрерывным повышением уровня кислорода и своевременным удалением сточных вод в течение всего периода выращивания. Перед началом и по окончании эксперимента каждую группу подопытных креветок взвешивали, рассчитывали среднюю скорость набора веса и коэффициент кормления.

Скорость набора веса = (масса креветки в конце эксперимента - масса креветки до эксперимента)/масса креветки до эксперимента × 100% Коэффициент кормления = расход корма/прирост веса

 

1.3 Стрессовые эксперименты, сбор и измерение образцов

После 6 недель выращивания был начат эксперимент с высокотемпературным стрессом. Каждую группу креветок поместили в экспериментальный горшок с температурой воды 35℃ на 48 ч. Во время эксперимента кислород постоянно увеличивали, а вмешательство человека уменьшали. До (0 ч) и через 6, 12, 24 и 48 ч после стресса из каждой параллельной группы случайным образом отбирали по 3 креветки для сбора гемолимфы, а из каждой группы концентрации отбирали по 9 образцов. Креветок быстро забирали, гемолимфу немедленно собирали в перикардиальную полость с помощью шприца объемом 1 мл и антикоагулировали равным объемом раствора гепарина натрия (0,02 г/мл). Гемолимфу центрифугировали при 10 000 об/мин при 4 ℃.

Через 10 минут надосадочную жидкость хранили при температуре -80 ℃ для дальнейшего использования. Глутатионтрансферазу (GSH-T), общую антиоксидантную способность (T-AOC), общую супероксиддисмутазу (T-SOD), каталазу (CAT) и малондиальдегид (MDA) определяли с помощью набора от Nanjing Jianjian Bioengineering Institute.

 

1.4 Анализ данных

Данные были проанализированы с помощью одностороннего ANOVA и множественных сравнений DUNCAN с использованием программного обеспечения SPSS 20.0[9], все результаты выражены как среднее ± стандартное отклонение, при этом P < 0,05 указывает на значительные различия.

 

2 Результаты и анализ

2.1 Влияние глутатиона на антиоксидантные показатели гемолимфы раков (Litopenaeus vannamei)

Результаты анализа глутатионтрансферазы (табл. 1) показали, что до стресса не было существенной разницы в содержании GSH-T в гемолимфе подопытных креветок в каждой экспериментальной группе. Группа с концентрацией 0,30 г/кг показала значительное увеличение содержания GSH-T в гемолимфе по сравнению с контрольной группой через 6 ч стресса, а группа с концентрацией 0,24 г/кг показала значительное увеличение содержания GSH-T в гемолимфе по сравнению с контрольной группой через 12 ч стресса, и влияние GSH на GSH-T было незначительным ниже концентрации 0,24 г/кг. Влияние GSH на GSH-T было неочевидным в группе с концентрацией 0,24 г/кг. В группе с шипами содержание GSH-T в гемолимфе имело тенденцию к увеличению с 24 ч после стресса, затем увеличилось до максимального значения через 24 ч, а затем снизилось и стабилизировалось.

 

Результаты определения общей антиоксидантной способности (табл. 2) показали, что до стресса не было существенной разницы в уровне T-AOC в гемолимфе подопытных креветок в каждой группе. В группе с концентрацией 0,30 г/кг наблюдалось значительное увеличение уровня T-AOC в гемолимфе по сравнению с контрольной группой через 6 ч стресса, а в группе с концентрацией 0,24 г/кг - значительное увеличение уровня T-AOC в гемолимфе по сравнению с контрольной группой через 12 ч стресса, причем влияние GSH на T-AOC было незначительным ниже этой концентрации. Влияние GSH на Т-АОК не было значительным ниже этой концентрации. Содержание Т-АОК в гемолимфе группы с шипами имело общую тенденцию к увеличению, а затем уменьшению после стресса, и достигло наивысшего значения через 12 ч после стресса.

 

Результаты анализа общей супероксиддисмутазы (табл. 3) показали отсутствие существенной разницы в уровне Т-СОД в гемолимфе подопытных креветок в группах до стимуляции. Через 6 ч после стресса уровень T-SOD в гемолимфе креветок в группах с концентрацией 0,24 г/кг и 0,30 г/кг значительно повысился по сравнению с контрольной группой.

В группе 0,18 г/кг уровень Т-СОД значительно увеличился через 24 ч после стресса, в то время как в группах 0,06 г/кг и 0,12 г/кг уровень Т-СОД в гемолимфе существенно не отличался от контрольной группы. Уровень Т-СОД в гемолимфе в группах с шипами имел общую тенденцию к увеличению, а затем снижению после стресса, достигая пика через 6 ч после стресса, а затем снижаясь до уровня ниже дострессового через 12 ч. Уровень Т-СОД в гемолимфе в группах с шипами был значительно выше, чем в контрольной группе.

 

Результаты каталазного анализа (табл. 4) показали, что существенной разницы в уровне КАТ в гемолимфе креветок опытных групп до стресса не было. Через 6 ч после стресса уровень КАТ в гемолимфе групп с концентрацией 0,24 г/кг и 0,30 г/кг значительно увеличился по сравнению с контрольной группой, в то время как уровень КАТ в гемолимфе групп с концентрацией менее 0,24 г/кг существенно не отличался от контрольной группы. Уровень КАТ в гемолимфе всех экспериментальных групп имел общую тенденцию к увеличению, а затем снижению после стресса, и достиг максимума через 12 ч после стресса, а затем снизился до уровня до стресса.

 

Результаты определения малондиальдегида (табл. 5) показали, что не было значительной разницы в уровне МДА в гемолимфе креветок экспериментальных групп до стресса. Уровень МДА в гемолимфе креветок во всех экспериментальных группах имел тенденцию к увеличению, а затем к снижению после стресса, и достиг максимального значения через 12 ч после стресса, а затем постепенно снизился и стал стабильным. Группы с концентрацией 0,24 г/кг и 0,30 г/кг показали значительное снижение уровня МДА через 12 ч после стресса по сравнению с контрольной группой, а группы с концентрацией 0,12 г/кг и 0,18 г/кг показали значительное снижение уровня МДА через 24 ч после стресса по сравнению с контрольной группой. Уровни МДА в группах с концентрацией 0,12 г/кг и 0,18 г/кг были значительно ниже, чем в контрольной группе через 24 ч после стресса, а через 48 ч различия не были значительными.

 

2.2 Влияние глутатиона на рост раков (Litopenaeus vannamei)

Вес тела экспериментальных креветок в каждой группе был измерен в конце эксперимента. Результаты (табл. 6) показали, что, за исключением группы 0,06 г/кг, скорость набора веса экспериментальных креветок существенно не отличалась от контрольной группы, а все остальные группы добавок показали значительное увеличение скорости набора веса; при этом коэффициенты кормления групп добавок 0,18, 0,24 и 0,30 г/кг были значительно ниже, чем у контрольной группы. Группа с добавкой 0,30 г/кг имела самую высокую скорость набора веса и самый низкий коэффициент кормления.

 

3 Обсуждение

3.1 Влияние глутатиона на антиоксидантную способность раков (Procambarus clarkii)

В результате стресса в организме животного образуется избыточное количество реактивных радикалов кислорода (РРК), что приводит к нарушению обмена веществ в организме и значительно ухудшает здоровье и питательный статус животного. Антиоксидантные ферменты, такие как глутатионсульфотрансфераза, глутатионредуктаза, супероксиддисмутаза, каталаза и т. д., способны уничтожать избыток свободных радикалов, а повышение активности этих антиоксидантных ферментов может помочь ослабить окислительный стресс, вызванный окислением полиненасыщенных жирных кислот, нитрозативным стрессом, голоданием и изменениями температуры[10] . В этом эксперименте кормление глутатионом значительно повысило уровень антиоксидантных ферментов в гемолимфе раков, что свидетельствует об усилении антиоксидантной способности данных особей. МДА является одним из важнейших продуктов перекисного окисления мембранных липидов, который может вызывать сшивание и полимеризацию макромолекул жизни, таких как белки и нуклеиновые кислоты, и, таким образом, обладает сильной цитотоксичностью, что может привести к повреждению организма[11,12] .

 

Поэтому измерение МДА может помочь понять степень перекисного окисления мембранных липидов и оценить опасность окислительного стресса. В данном эксперименте кормление глутатионом значительно снизило уровень МДА в гемолимфе раков во время высокотемпературного стресса, что свидетельствует о том, что глутатион может эффективно повысить стрессоустойчивость организма и уменьшить окислительные повреждения, вызванные высокотемпературным стрессом. Результаты этого эксперимента согласуются с результатами других исследований на водных животных. Согласно данным исследований, добавление глутатиона в рацион травяного карпа (Ctenopharyngodon idellus) может значительно повысить уровень глутатиона в печени, активность глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы, а также значительно улучшить антиоксидантную способность, неспецифический иммунитет и показатели роста травяного карпа [ 13 - 16 ]. У Oreochromis niloticus добавление 0,24 г/кг глутатиона значительно повышало активность глутатионтрансферазы печени, общую антиоксидантную способность, активность супероксиддисмутазы, активность каталазы и существенно снижало содержание малондиальдегида [17]. Глутатион значительно повышал активность антиоксидантных ферментов и общую антиоксидантную способность в гепатопанкреасе Litopenae-us vannamei [18] и Haliotis discus hannai Ino [19].

 

3.2 Влияние глутатиона на рост раков (Procambarus clarkii)

Многие исследования показали, что глутатион оказывает стимулирующее рост действие на водных животных. Чжоу Янлинг[20] обнаружил, что скорость набора веса пельтеобагруса (Pelteobagrus ful- vidraco) имеет тенденцию к увеличению, а затем к уменьшению при увеличении содержания глутатиона в рационе, а показатели роста достигли максимума при 0,30 г/кг, что было значительно выше, чем в контрольной группе. Добавление глутатиона в рацион значительно увеличило удельную скорость роста и выживаемость карпа и снизило коэффициент кормления, а удельная скорость роста была максимальной при 300 мг/кг, что на 10,08% выше, чем в контрольной группе [15]. Liu et al.[21] показали, что добавление глутатиона к основному рациону креветок Penaeus vannamei значительно увеличило их прирост массы и эффективность конверсии корма, а выживаемость всех групп была значительно выше, чем у контрольной группы. Максимальный прирост массы был достигнут при добавлении глутатиона в рацион в концентрации 0,18 г/кг.

 

Настоящий эксперимент также подтвердил, что добавление глутатиона в концентрации более 0,18 г/кг может значительно увеличить скорость роста раков и снизить коэффициент приманки. Что касается механизма стимулирования роста глутатионом, было показано, что глутатион может повышать экспрессию генов инсулиноподобного фактора роста I и гормона роста, увеличивать секрецию гормона роста, тиреотропного гормона и инсулиноподобного фактора роста I, что может способствовать росту тиляпии[17,22,23]. Мы предполагаем, что помимо стимулирования секреции гормона роста, стимулирующее рост действие глутатиона также связано с его антистрессовым эффектом. Согласно результатам предыдущих исследований, раки потребляют большое количество глюкозы, белка и жира, чтобы справиться и устранить негативные последствия высокотемпературного стресса[3], но глутатион эффективно снижает стрессовую реакцию организма, уменьшает потребление вышеперечисленных питательных веществ, а также косвенно способствует накоплению питательных веществ и увеличению массы тела. Механизм стимулирования роста глутатионом нуждается в дальнейшем изучении с точки зрения материального и энергетического метаболизма.

 

Ссылки.

[1] Китайское общество рыболовства. 2020 Китай раки промышленности развития доклад выпущен [ J] . Aquatic Science and Technology Intelligence, 2020, 47(4) : 229.

[2] Xie Jing , Wang Qi . Прогресс экологического стресса и механизмы физиологического контроля при транспортировке живых водных животных[J]. Food Science, 2021, 42(1) : 319 - 325.

[3] Liu Qigen , Li Yingsen , Chen Lansun . Экологическая культура раков (Procambarus clarkii)① - Биология раков [ J]. Aquatic Science and Technology Information , 2008 , 35(1) : 21 - 23.

[4] XU Jin , WEI Kaijin , XU Bin , et al. Физиологический ответ раков на высокотемпературный стресс[ J]. Пресноводное рыболовство, 2017, 47(6) : 9 - 13.

[5] XU Jin , WEI Kaijin , LU Jianchao . Влияние высокотемпературного стресса на иммуноферментную активность и устойчивость к WSSV-инфекции у раков [ J] . Пресноводное рыболовство , 2019 , 49 ( 2 ): 109 - 113.

[6] Dai Pangcong , Wu Hui . Обсуждение прогресса исследований применения глутатиона[ J]. Современная пища, 2020, (21): 40 - 43.

[7] Wang Xiaowei , Zhang Hongyan , Liu Ri , et al. Прогресс исследований глутатиона[ J]. Chinese Journal of Pharmacy ( online version ), 2019 , 17(4) : 141 - 148.

[8] Хельмут С. Глутатион и его роль в клеточных функциях [ J]. Free Radic Biol Med , 1999 , 27(9 - 10) : 916 - 921.

[9] Liu Bo , Xie Jun , Gao Xianping , et al. Влияние экстракта антрахинона из Rheum officinale на устойчивость к высокотемпературному стрессу у Penaeus rosenbergii[ J]. Journal of Zhongshan University (Natural Science Edition), 2009, 48(6) : 109 - 114.

[10] HU Wenqin , WANG Teneng , MENG Qingli . Механизмы образования и удаления реактивных видов кислорода у животных [ J]. Экология животноводства, 2004, (3): 64 - 67.

[11] Zhou Xianqing , Liang Hongmeng . Изменения содержания перекиси липидов и активности антиоксидантных ферментов в печени мыши при стрессе скученности[J]. Зоологические исследования, 2003, (3): 238 - 240.

[12] Liu Yang. Влияние различной интенсивности тренировок на содержание МДА в сыворотке крови и активность СОД у мышей[ J]. Heilongjiang Animal Husbandry and Veterinary Medicine , 2016 , (23) : 231 - 233.

[13] XU Deli , ZHAO Xiaoli , ZHANG Ming . Изменения содержания малондиальдегида в клеточной линии травяного карпа ZC-7901 при низкотемпературном стрессе[ J]. Journal of Qufu Normal University (Natural Science Edition), 2003, (4) : 88 - 90.

[14] Jian H M , Jin Y Y , Yi X Z , et al. Влияние диеты с пониженным содержанием глю- татиона на производительность роста, неспецифический иммунитет, антиокс- идантный потенциал и Влияние рациона с пониженным содержанием глютатиона на производительность роста, неспецифический иммунитет, антиокс идантную способность и уровни экспрессии IGF - I и HSP70 мРНК травяного карпа (Ctenopharyngodon idella) [ J].Aquaculture , 2015 , 438 : 39 - 46.

[15] Zhao Hongxia , Tan Yonggang , Zhou Meng , et al. Влияние диетического глутатиона на рост, физиологические показатели и устойчивость к заболеваниям травяного карпа [ J]. Chinese Aquatic Science, 2007, (4): 678 - 683.

[16] ZHU Xuan , CAO Junming , ZHAO Hongxia , et al. Влияние диетического глутатиона на осаждение глутатиона и антиоксидантную способность травяного карпа [ J]. C o n s e r v a t i o n o f A n i m a l S c i e n c e , 2008, (1) : 160 - 166.

[17] Zhou Tingting. Влияние глутатиона на производительность роста и антиоксидантную функцию тиляпии Jifu [ D]. Ухань: Хуачжунский сельскохозяйственный университет, 2012.

[18] Liu Xiaohua , Cao Junming , Wu Jiankai , et al. Влияние диетического глутатиона на гепатопанкреатические антиоксидантные индексы и перекиси липидов у Penaeus vannamei[J] .  Журнал водных наук, 2007, (2): 235 - 240.

[19] Chen Qiyong. Влияние диетической α-липоевой кислоты, глутатиона и селена на рост и антиоксидантные реакции абалонов Hali- otis discus hannai Ino [ D] . Циндао, Шаньдун: Океанский университет Китая, 2010.

[20] Zhou Yanling ． Влияние глутатиона на производительность роста и антиоксидантную функцию Pelteobagrus fulvidraco [ D]. Wuhan:Huazhong Agricultural University , 2018.

[21] Liu Xiaohua , Cao Junming , Wu Jiankai , et al. Влияние диетического глутатиона на рост и биохимию тканей Penaeus vannamei[J]. Journal of Aquatic Biology, 2008, 32(3) : 440 - 444.

[22] Zhou Tingting , Cao Junming , Huang Yanhua , et al. Влияние диетического глутатиона на рост печени и экспрессию мРНК генов, связанных с антиоксидантами, у тиляпии Jifu[J] .  Guangdong Agricultural Science, 2012, 39(14) : 146 - 149.

[23] Jiao Caihong. Влияние глутатиона на рост тиляпии и его механизм[ D] . Гуанчжоу: Южно-Китайский сельскохозяйственный университет, 2004.