Глутатион (GSH) - это реактивный трипептид, образующийся в результате конденсации глутаминовой кислоты, цистеина и глицина. Он широко распространен в клетках растений, животных и микроорганизмов и является важнейшим небелковым сульфгидрильным соединением с важными физиологическими функциями. Он может использоваться в качестве кофермента некоторых ферментов, оказывает активирующее действие на некоторые сульфгидрильные ферменты, является своего рода антиоксидантом для защиты ферментов и других белковых сульфгидрильных групп, играет важную роль в транспорте аминокислот, поддержании целостности мембраны эритроцитов, защите гемоглобина, высвобождении токсинов и т. д. [1]. В клинической практике глутатион является важным биохимическим препаратом для лечения заболеваний печени, опухолей, отравлений, катаракты, старения и аллергических реакций. В последние годы, с открытием новых физиологических функций глутатиона, он привлек большое внимание к пищевым добавкам, клинической медицине и спортивному питанию, и спрос на глутатион растет.
С тех пор как глутатион был впервые выделен из дрожжей Хопкином [2], он был широко изучен. В настоящее время экстракция растворителем и химический синтез являются самыми современными методами получения высокочистого глутатиона. Однако эти два метода сопряжены с такими проблемами, как громоздкость процесса, высокая стоимость и легкое загрязнение окружающей среды. Поэтому биологический метод, преимущества которого заключаются в мягких условиях реакции, низкой стоимости и простых этапах реакции, будет наиболее перспективным методом получения глутатиона в будущем, а получение высокопродуктивных штаммов с отличной производительностью является ключом к получению глутатиона этим методом. В настоящее время сообщается [3-5], что штаммы, способные накапливать больше глутатиона, - это в основном дрожжи и большинство грамотрицательных бактерий, а используемые методы селекции и размножения штаммов - это в основном сочетание традиционного химического мутагенеза (нитрозогуанидин, диэтилсульфат, этилметансульфонат и др.) и физического мутагенеза (ультрафиолетовый свет и рентгеновские лучи), а полученные мутантные штаммы - это в основном 1,2,4-триазол и азид натрия, устойчивые к этионину и этионину штаммы, которые могут производить глутатион по данному методу. Полученные мутантные штаммы были в основном устойчивы к 1,2,4-триазолу и азиду натрия, устойчивы к этионину, чувствительны к метионину, устойчивы к пирувату и устойчивы к дисульфиду тетраметилтолуола. Однако об использовании Y-лучей для мутации штаммов, продуцирующих глутатион, и получения высокоурожайных штаммов, устойчивых к ZnCl, в Китае не сообщалось.
Авторы отобрали штамм Saccharomyces cerevisiae с определенной способностью к производству глутатиона из более чем 200 штаммов дрожжей, собранных и сохраненных в лаборатории, и получили бактерию с высокой продукцией глутатиона, устойчивую к хлориду цинка и этилтионину, путем дальнейшего УФ- и Y-лучевого мутагенеза. В этой статье мы сообщаем о скрининге и селекции этого штамма, чтобы заложить основу для промышленного применения.
1 Материалы и методы
1 . 1 Источники штаммов
Saccharomyces cerevisiae (S . cerevisiae), собранные и сохраненные в микробиологической лаборатории Чжэцзянского технологического университета. 1 .2 Культуральная среда и условия культивирования
1 .2 . 1 Наклонная среда (полная среда) и условия культивирования:
Культуральная среда: дрожжевая паста 3 г, сусло 3 г, пептон 5 г, глюкоза 10 г, агар 20 г, объем до 1 л воды, PH естественный, 1 × 105 па Стерилизация 20 мин. Условия культивирования: 28℃, 1~2д.
1 .2 .2 Среда для выделения пластин и условия культивирования: среда:
(1) Среда отбора Zncl2: жидкая среда + 1,360 мг/л Zncl2, pH естественный, 1 × 105 па Стерилизация в течение 20 мин; (2) Среда отбора этионина: жидкая среда
Условия культивирования: 28℃, инкубация в течение 5-7 дней. Условия культивирования: 28℃, 5-7д.
1 .2 .3 Посевная среда и условия культивирования:
Среда: глюкоза 18 г, сахароза 12 г, пептон 30 г, дрожжевая паста 1 г, NH4 H2 pO4 0 . 55г, (NH4)2 SO4 12г, MgSO4 -6H2 O 2г , FeSO4 -7H2 O 0 . 1г, инозитол 75мг, биотин 24мкг, витамин B1 0 . 8мг, 10г солодового сусла, и фиксируется в 1л воды, pH 4 . 5 ~ 5 . 5, 0,70 × 105 па, стерилизуют в течение 30 мин. Условия культивирования: 250 мл треугольный флакон с 30 мл среды, 28℃, инкубировали в течение 2 ~ 3 дней, скорость встряхивания 200 об/мин.
1 .2 .4 Ферментационная среда и условия культивирования:
Среда: посевная среда + 200 мг/л L-цистеина гидрохлорида, pH 4 . 5 ~ 5 . 5, 0 . 7 × 105 па Стерилизация в течение 30 мин. Условия культивирования: треугольный флакон объемом 250 мл, содержащий 30 мл среды, объем инокулята 10%, температура 28℃, инкубация в течение 3 дней, скорость встряхивания 200 об/мин.
1 .3 Основные инструменты
Вертикальный паровой стерилизатор LS-B50L, Шанхайский завод медицинских ядерных приборов; Спектрофотометр 751-GW, Шанхайский завод аналитических приборов; Настольная высокоскоростная морозильная центрифуга Labofuge 400R, сделано в Германии.
1 .4 Мутагенная обработка
1 .4 . 1 Обработка ультрафиолетом:
Возьмите свежую культуру, культивируемую в течение 1~2 дней, промойте бактериальное тело стерильным физиологическим раствором, чтобы получить бактериальную суспензию, и получите одноклеточную суспензию после колебания стеклянных шариков и фильтрации обезжиренной ватой, установите количество бактерий в суспензии около 108/мл, аспирируйте 3 мл бактериальной суспензии в стерильную маленькую чашку Петри, а затем под облучением 15 Вт ультрафиолетовой лампы (на расстоянии 30 см), перемешивая с помощью магнитной силы.
30 с, бактериальная суспензия была соответствующим образом разведена и нанесена на пластину под красным светом в стерильной комнате, пластина была перевернута и инкубирована в инкубаторе при постоянной температуре 28℃ в течение 5 дней.
7d.
1.4.2 Облучение 60co Y-лучами: Для прямого облучения использовались свежие культивированные пробирки. Облучение проводилось с мощностью 0,5KGY, 2,5KGY, 2,5KGY и 2,5KGY соответственно. 5KGY, 2.0KGY и 0.5KGY соответственно. 0,5KGY, 2,0KGY дозы 60coY облучения бактерий в пробирках, со стерильным физиологическим раствором будет облучен косой квадрат в число бактериальных данных суспензии, и после соответствующего разбавления покрыты пластины, пластина была перевернута в 28 ℃ термостат инкубации в течение 5 ~ 7 d. Пластина затем был помещен в постоянной температуре коробки.
1 .5 Процедура мутагенеза штаммов
Штамм выбытия → УФ-облучение → естественная изоляция → облучение 60cO Y-лучами → бактерии, продуцирующие глутатион. 1 .6 Методы анализа
1 .6 . 1 Измерение содержания внутриклеточного глутатиона:
Метод дериватизации реагентами ALLOXAN, см. литературу [6].
1 .6 .2 Определение биомассы:
10 мл ферментационного бульона центрифугировали при 4500 об/мин в течение 4 мин и собрали организмы. Организмы дважды промыли дистиллированной водой, супернатант отбросили, а влажные организмы высушили при 105°C до постоянной массы и взвесили.
2 Результаты
2 . 1 Определение исходного мутагенного штамма
После первичного и вторичного скрининга в колбах с встряхиванием более 200 штаммов дрожжей, собранных и сохраненных в нашей лаборатории, пивные дрожжи № 346 показали самый высокий выход глутатиона и содержание глутатиона: 36,88 мг/л глутатиона на грамм сухих клеток. Выход глутатиона составил 36,88 мг/л, а содержание глутатиона на грамм клеток стебля - 4,72 мг. Выход глутатиона составил 36,88 мг/л, а содержание глутатиона - 4,72 мг на грамм сухих клеток, и было решено использовать штамм 346 в качестве исходного штамма для селекции мутаций.
2 .2 Выбор концентрации zncl2 в скрининговых пластинах
zn2+ является кофактором для различных дегидрогеназ, декарбоксилаз и пептидаз [7], а также микроэлементом, необходимым для роста дрожжей. При низких концентрациях zn2+ может способствовать росту дрожжей [8], но при высоких концентрациях он оказывает бактерицидное и бактериостатическое действие на дрожжи. Концентрация zncl2 и летальность показаны на рис. 1, из которого видно, что существует четкая дозо-эффективная зависимость между концентрацией zncl2 в среде и летальностью экспериментальных штаммов, причем с увеличением концентрации zncl2 летальность постепенно увеличивается. При концентрации zncl2 680 мг/л летальность составляет 80%, а при концентрации zncl2 более 2 040 мг/л летальность достигает 100%. В данной работе была выбрана летальность 93,5% от концентрации zncl2. В данной работе для летальности 93,5% была выбрана доза концентрации zncl2 1 360 мг/л для селективной пластины.
2 .3 Мутагенная обработка ультрафиолетом
Штамм 346 был подвергнут ультрафиолетовой мутации, и суспензию мутировавшего штамма разложили на полную среду и среду селекции zncl2, и быстрорастущие одиночные колонии с крупными колониями были отобраны из пластин для инокуляции слантом после инкубации, и мутантные штаммы и исходные штаммы были инокулированы в посевную среду и среду ферментации соответственно, и биомасса и выход глутатиона были определены в конце ферментации, результаты приведены в таблицах 1 и 2.
В таблице 1 показано, что среднее содержание глутатиона и урожайность штаммов, устойчивых к УФ-излучению и мутантных штаммов zncl2, были выше, чем у развивающегося штамма и мутантного штамма, устойчивого к УФ-излучению, а положительный показатель также был выше, чем у мутантного штамма, устойчивого к УФ-излучению, что доказывает, что эффект скрининга при использовании zncl2 в качестве агента для скрининга высокоурожайных мутантных штаммов был значительно лучше, чем при традиционном случайном скрининге. Таблица 2 показывает, что: (1) Устойчивый к УФ-излучению штамм uvzn10-3 и мутантный штамм zncl2 показали самые высокие содержание глутатиона и урожайность, с 11,38 мг глутатиона на грамм стволовых клеток, что выше, чем у исходного штамма. Содержание глутатиона на грамм стеблевых клеток достигло 11,38 мг, что на 141,1 % выше, чем у штамма-вспышки. Содержание глутатиона на грамм стволовых клеток составило 11,38 мг, что на 141,1% выше, чем у исходного штамма. Выход глутатиона составил 92,2 мг/л, что на 150 % выше, чем у исходного штамма.(2) Глутатион является внутриклеточным продуктом, и определенное количество биомассы является необходимым условием для высокого выхода. Штамм uvzn10-3 продуцировал 92,2 мг/л глутатиона, а его биомасса составила 92,2 мг/л, что является самым высоким выходом глутатиона. 2 мг/л, а его биомасса составляла всего 8. Биомасса uvzn10-5 составляла 8,2 г/л, а биомасса uvzn10-5 - 11,9 г/л. Биомасса штамма uvzn10-5 составляла 11,9 г/л, но выход глутатиона был всего 35,96 мг/л. Биомасса uvzn10-5 составляла 11,9 г/л, но выход глутатиона - только 35,96 мг/л, что свидетельствует о том, что биомасса не пропорциональна выходу. Поэтому при селекции штаммов следует отбирать мутантные штаммы с высоким содержанием глутатиона, а биомассу следует увеличивать путем оптимизации условий культивирования, чтобы повысить урожайность.
Чтобы избежать примеси штамма, вызванной явлением фенотипической задержки, в дальнейшем был выделен устойчивый к zncl2 мутантный штамм uvzn10-3 в естественных условиях, и было получено увеличение продукции глутатиона на 41,83% по сравнению со штаммом uvzn10-3. На 83% выше выход глутатиона по сравнению со штаммом uvzn10-3.
2 . 4 60 Обработка мутагенеза лучами COY
В качестве исходного штамма использовали H8 после дозы 2 . В качестве исходного штамма использовали H8. После облучения радиацией 60 сои в дозах 2,0KGY и 0,5KGY мутагенизированную бактериальную суспензию разложили на полную среду, среду отбора хлорида цинка и среду отбора этионина, и 20 быстрорастущих одиночных колоний с большим размером колоний были отобраны для инокуляции посевного материала, а затем биомассу и продукцию глутатиона определили после вторичной ферментации в колбах для встряхивания, и результаты были такими, как показано на рис. 2.
Как видно из рис. 2, доза облучения 0,5KGY была выше, чем 2,5KGY. 5KGY была лучше, чем 2,0KGY. 0KGY, что согласуется с точкой зрения, согласно которой низкая доза облучения благоприятствует селекции положительных мутантных штаммов, о чем сообщается во многих литературных источниках. В шести группах экспериментов доза облучения 0,5KGY была лучше, чем 2,0KGY. Среди шести групп экспериментов штаммы, облученные 0,5KGY и покрытые пластинками этионина, показали наилучшие результаты, причем не только амплитуда положительных мутаций была большой, но и амплитуда положительных мутаций была высокой. Это связано с тем, что этионин является метаболическим аналогом глутатиона, и устойчивый к этионину мутантный штамм может эффективно освободить регуляцию обратной связи самой бактерии, поэтому такой режим скрининга способствует отбору положительных мутантных штаммов. Среди мутантов, облученных Y-лучами, был обнаружен устойчивый к этионину мутант 0,5Eth400-5, обладающий следующими характеристиками. Среди штаммов-мутантов, облученных Y-лучами, мутант 0,5Eth400-5, устойчивый к этионину, был лучшим, с выходом глутатиона 165,96 мг/л, что было выше, чем у исходного мутанта. Выход глутатиона у этого штамма составил 165,96 мг/л, что на 350 % выше, чем у исходного штамма, а содержание глутатиона на грамм стволовых клеток - 19,76 мг, что выше, чем у исходного штамма. Выход глутатиона из этого штамма составил 165,96 мг/л, что на 350 % выше, чем у исходного штамма. Выход глутатиона из этого штамма составил 165,96 мг/л, что на 350 % выше, чем у исходного штамма.
2 . 5 Исследование стабильности мутантных штаммов
Стабильность гена высокой урожайности B. glutamicum исследовали методами последовательной популяции и периодической передачи при криоконсервации. Результаты представлены в таблице 3. Результаты показали, что штамм 0.5Eth400-5 передавался на сланце в течение 10 последовательных поколений. При передаче штамма 0.5Eth400-5 в течение 10 последовательных поколений продукция глутатиона снизилась на 10,7%. 7%. В то же время, штамм хранился в холодильнике при низкой температуре 4℃, и производство глутатиона снизилось только на 6% за 4 поколения, что указывает на хорошую стабильность мутантного штамма, но необходимо периодически проводить повторное укрепление штамма.
3 Обсуждение
3 . 1 Скрининг мутантов, устойчивых к хлориду цинка
Внутриклеточно глутатион окисляется до окисленного глутатиона (GSSG) глутатионпероксидазой (GSH-PX) в результате ее участия во внутренних антиоксидантах (например, при выведении из эритроцитов метаболически образующегося H2 02), а GSSG превращается в активный восстановленный глутатион с помощью глутатионредуктазы. В реакции (2) глутатионредуктаза является регуляторным ферментом и ингибируется внутриклеточным zn2+ . При определенном количестве активный центр глутатионредуктазы деформируется и инактивируется, прекращая производство GSH [9]. Когда внутриклеточный zn2+ достигает уровня, при котором бактериальные клетки не могут разлагать токсичные сильные оксиды, они погибают. Устойчивый к хлориду цинка мутантный штамм uvzn10-3 был способен расти на пластинах с высоким содержанием znCl2, что снимало ингибирование глутатионредуктазы под действием zn2+. Таким образом, добавление znCl2 в культуральную среду может способствовать росту дрожжей и увеличению биомассы без ингибирования восстановления GSSG, что увеличивает продукцию глутатиона.
3 .2 Скрининг мутантных штаммов, устойчивых к этионину
Биосинтез глутатиона напрямую контролируется синтазой по следующему механизму:
L-глутаминовая кислота + L-цистеин глутамилцистеин (1)
Y-глутамилцистеин + глицин Глутатион (2) Реакция (1) является контрольным этапом биосинтеза глутатиона, который катализируется Y-глутамилцистеинсинтетазой (GSH-I), регуляторным ферментом, подверженным ингибированию по обратной связи конечным продуктом - глутатионом. Когда определенное количество глутатиона накапливается внутриклеточно, глутатион связывается с регуляторным участком в молекуле фермента и инактивирует активный центр фермента, тем самым ингибируя дальнейший синтез глутатиона [4]. Этионин - метаболический аналог глутатиона, который также связывается с регуляторным сайтом GSH-I. Поскольку этионин не участвует в синтезе белка, его концентрация в клетке не снижается, поэтому восстановить активность фермента GSH-I после связывания сложно, и бактерия не может продолжать синтез GSH, а погибает из-за накопления в клетке избыточного количества токсичных веществ.
Используя в качестве исходного штамма мутант, устойчивый к хлориду цинка, методом 60COY был выделен мутантный штамм, устойчивый к аналогу метаболизма глутатиона - этионовой кислоте, который мог эффективно устранять ингибирование GSH-I глутатионом по обратной связи и, таким образом, увеличивать содержание глутатиона в бактерии.
3 .3 Заключение
Устойчивый к хлориду цинка и этионину мутантный штамм 0.5Eth400-5 был получен методом селекции по принципу инференции с использованием данных экстра-квадратных линий и 60COY-излучения для мутагенизации исходного штамма. 5Eth400-5 ферментировали в колбах со встряхиванием и получили 165,96 мг/л глутатиона. В результате ферментации этого штамма выход глутатиона составил 165,96 мг/л, при этом на грамм стволовых клеток приходилось 19,26 мг глутатиона. 19,26 мг глутатиона на грамм стволовых клеток. Этот эксперимент продемонстрировал, что использование устойчивых к ZnCl и этионину штаммов в качестве скрининговой модели может быть использовано для отбора и селекции бактерий с высоким уровнем продуцирования глутатиона.
Ссылки:
[1] Чжэн Юньлань . Биологический вестник, 1995, 30(5): 22 ~ 24 . [2] Hopkins F G. J Biochem, 1921, 15: 286 ~ 305 .
[3] Murata K, Kimura A. Biotechnol Adv, 1990, 8(1): 59 ~ 96 .
[4] Zhan Gu-Yu, Tian Ping, Liu We-Dong, et al. Journal of Pharmacy, 1990, 25(7): 494 ~ 499 . [5] Kimura A, Murata K. Патент США 4, 598, 046, 1986-07-01 .
[6] Shen Beiying, Jiang Zhiwei. Зерно и масло, 1993, 2: 27 ~ 32 .
[7] Чжоу Дэцин . Учебник микробиологии . Пекин: Издательство высшего образования, 1993 . 104 ~ 105 .
［8］Пища Чан Сзе-Фун, Сиу Хи-Пуи. Биохимия дрожжей . Цзинань: Издательство науки и техники Шаньдуна, 1990 . 61 .
[9] Walther U I, Wilhelm B, Walther S. In vitro Mol Toxicol, 2000, 13(2): 145 ~ 151 .
评论
发表评论